Lisi cellulare:
- La procedura di lisi inizia tipicamente con la risospensione delle cellule batteriche in un tampone contenente NaOH. Questo tampone crea un ambiente alcalino con un pH elevato, solitamente intorno a pH 12-12,8.
- A questo pH elevato, le membrane cellulari e le pareti cellulari dei batteri vengono danneggiate, portando alla lisi cellulare. I componenti cellulari, compreso il DNA plasmidico, vengono rilasciati nel lisato.
Denaturazione del DNA cromosomico:
- L'ambiente a pH elevato creato da NaOH prende di mira e denatura specificamente il DNA cromosomico dei batteri. Il DNA cromosomico è tipicamente grande e complesso, costituito da una singola molecola circolare.
- Le forti condizioni alcaline causano la rottura dei legami idrogeno tra i filamenti complementari del DNA, con conseguente denaturazione e frammentazione del DNA cromosomico. Questa denaturazione distrugge efficacemente l'integrità strutturale del DNA cromosomico, rendendolo non funzionale.
Conservazione del DNA plasmidico:
- A differenza del DNA cromosomico, il DNA plasmidico è più resistente alla denaturazione da parte di NaOH. Le molecole del plasmide sono tipicamente piccole, circolari e a doppio filamento, con una struttura superavvolta che ne migliora la stabilità.
- La conformazione superavvolta del DNA plasmidico gli consente di resistere alle condizioni alcaline meglio del DNA cromosomico. Pertanto, mentre il DNA cromosomico viene denaturato, il DNA plasmidico rimane intatto e mantiene la sua struttura circolare covalentemente chiusa.
Neutralizzazione:
- Dopo la fase di lisi, il lisato contenente il DNA cromosomico denaturato e il DNA plasmidico intatto viene neutralizzato utilizzando un tampone contenente un agente neutralizzante, come Tris-HCl o tampone acetato.
- La neutralizzazione riporta il pH del lisato entro un range fisiologico, tipicamente intorno al pH 7-8. Questo passaggio è essenziale per arrestare il processo di denaturazione e garantire la stabilità del DNA plasmidico.
Isolamento del DNA plasmidico:
- Dopo la neutralizzazione, il lisato può essere ulteriormente processato per isolare il DNA plasmidico. Ciò può comportare passaggi aggiuntivi come la centrifugazione, la purificazione e le tecniche di separazione basate sulle dimensioni per separare il DNA plasmidico da altri componenti cellulari.
Denaturando selettivamente il DNA cromosomico preservando l'integrità del DNA plasmidico, NaOH svolge un ruolo fondamentale nella procedura di lisi, consentendo l'isolamento efficiente di molecole plasmidiche chiuse covalentemente per varie applicazioni a valle, tra cui sequenziamento del DNA, clonazione ed esperimenti di ingegneria genetica.
