1. Nick Translation:
* Reazione: Questo metodo utilizza l'enzima DNA polimerasi I per sostituire i nucleotidi in un filamento di DNA con nucleotidi marcati. Funziona introducendo pause a filamento singolo (Nicks) nel DNA usando DNase I . La polimerasi utilizza quindi il nick come primer e incorpora nucleotidi marcati nel gap.
* Isotopi: Gli isotopi comunemente usati sono ³²p-DCTP o ³²p-Datp .
* Vantaggi: Produce un'elevata attività specifica (densità dell'etichetta) ed è adatto per il DNA a singolo e doppio filamento.
* Svantaggi: Richiede un enzima specifico e può essere sensibile alle condizioni del tampone.
2. Etichettatura del primer casuale:
* Reazione: Questo metodo utilizza i primer a oligonucleotidi casuali corti e DNA polimerasi I (Frammento di klenow) per sintetizzare un nuovo filamento di DNA complementare al filamento del modello. La polimerasi incorpora nucleotidi marcati durante la sintesi.
* Isotopi: Gli isotopi comunemente usati sono ³²p-DCTP o ³²p-Datp .
* Vantaggi: Efficiente e può essere utilizzato per etichettare il DNA a singolo e doppio filamento.
* Svantaggi: Può introdurre alcune etichettature di sfondo a causa del legame casuale del primer.
3. Etichettatura finale con chinasi:
* Reazione: Questo metodo utilizza polinucleotide chinasi Per aggiungere un gruppo di fosfato all'estremità 5 'di un frammento di DNA. Il gruppo fosfato è etichettato con un isotopo radioattivo.
* Isotopi: In genere ³²p-atp o ³³p-atp sono usati.
* Vantaggi: Semplice e semplice, particolarmente utile per etichettare corti frammenti di DNA.
* Svantaggi: Etichetta solo la fine del 5 'del DNA.
4. Etichettatura PCR:
* Reazione: Questo metodo prevede l'uso di dNTPS radioattivo (come ³²p-dctp ) durante la reazione PCR. Ciò incorpora l'etichetta nei fili DNA appena sintetizzati.
* Isotopi: Gli isotopi comunemente usati sono ³²p-DCTP o ³²p-Datp .
* Vantaggi: Efficiente e può essere utilizzato per etichettare sequenze di DNA specifiche.
* Svantaggi: Può essere meno efficiente rispetto ad altri metodi e può essere difficile ottenere attività specifiche elevate.
5. Trascrizione in vitro:
* Reazione: Usa RNA polimerasi Per trascrivere un modello di DNA in RNA. L'RNA è etichettato con nucleotidi radioattivi durante la sintesi.
* Isotopi: In genere ³²p-utp o ³⁵s-utp .
* Vantaggi: Può produrre sonde RNA altamente etichettate per studi di ibridazione.
* Svantaggi: Richiede reagenti e condizioni specializzate per la trascrizione in vitro.
La scelta del metodo di etichettatura dipende dall'applicazione specifica e dalle proprietà desiderate del DNA etichettato.
Nota: L'uso di isotopi radioattivi è diminuito negli ultimi anni a causa di problemi di sicurezza e della disponibilità di metodi di etichettatura non radioattivi. Tuttavia, l'etichettatura radioattiva presenta ancora alcuni vantaggi in alcune applicazioni, in particolare per la sensibilità e la capacità di rilevare obiettivi a bassa abbondanza.
