I ricercatori hanno sviluppato una combinazione di hardware disponibile in commercio e software open source, chiamato PySight, che migliora l'imaging rapido 2-D e 3-D del cervello e di altri tessuti. Consentendo senza soluzione di continuità l'integrazione della soluzione di imaging 3D più veloce disponibile oggi, il progresso della microscopia potrebbe aiutare gli scienziati a comprendere meglio le dinamiche cerebrali e scoprire nuovi trattamenti per problemi di salute come l'ictus, epilessia e demenza.

In ottica , La rivista della Optical Society per la ricerca ad alto impatto, i ricercatori descrivono PySight, che funge da componente aggiuntivo per i microscopi a scansione laser. Grazie a questa nuova combinazione di software e hardware, hanno migliorato la qualità dell'imaging 2-D e 3-D dell'attività neuronale nel cervello vivente.

Perché può immaginare in profondità nei tessuti, una tecnica di imaging basata sul laser nota come microscopia multifotonica viene spesso utilizzata per studiare i modelli di attività rapida dei neuroni, vasi sanguigni e altre cellule ad alta risoluzione nel tempo. Questo metodo di microscopia utilizza impulsi laser per eccitare sonde fluorescenti, suscitando l'emissione di fotoni, alcuni dei quali vengono rilevati e utilizzati per formare immagini 2-D e 3-D.

Il tentativo di catturare l'intera ampiezza dell'attività neuronale con la microscopia multifotonica costringe gli scienziati a acquisire immagini più velocemente. Di conseguenza, sempre meno fotoni diventano disponibili per formare immagini, proprio come scattare una foto con tempi di esposizione sempre più brevi. La sfida diventa quindi come ottenere immagini significative in queste condizioni di scarsa illuminazione.

"Per affrontare questa sfida, i microscopisti hanno utilizzato un metodo di lettura del rivelatore chiamato conteggio dei fotoni, ", ha affermato il leader del gruppo di ricerca Pablo Blinder dell'Università di Tel Aviv in Israele. "Tuttavia, perché la sua implementazione richiedeva una vasta conoscenza dell'elettronica e componenti personalizzati, il conteggio dei fotoni non è mai stato ampiamente adottato. Inoltre, le soluzioni di conteggio dei fotoni disponibili in commercio non erano adatte per eseguire immagini molto veloci come quelle richieste per l'imaging 3D. La semplice procedura di installazione di PySight e la sua integrazione con hardware all'avanguardia eliminano tali problemi."

Oltre a far progredire la ricerca sull'imaging neurale, La maggiore sensibilità di PySight potrebbe facilitare la rapida identificazione intraoperatoria delle cellule maligne nei pazienti umani utilizzando la microscopia multifotonica. Il nuovo approccio di PySight per la ricostruzione di scene 3D potrebbe anche migliorare le prestazioni di rilevamento e distanza della luce, o LIDAR. Ciò potrebbe aiutare a ridurre i costi delle auto a guida autonoma che utilizzano LIDAR per mappare l'ambiente circostante.

Rilevamento di singoli fotoni in 3-D

PySight fornisce un'elevata risoluzione spazio-temporale mentre produce un flusso di dati che scala con il numero di fotoni rilevati, non il volume o l'area da acquisire. "L'hardware di acquisizione dati convenzionale memorizza la luminosità di ogni pixel o voxel 3D anche quando è zero poiché non sono stati rilevati fotoni in quella particolare posizione, " Spiegò Blinder. "PySight, però, memorizza solo il tempo di rilevamento preciso di ciascun fotone. Se non sono stati rilevati fotoni, nulla viene scritto su disco. Ciò consente ai ricercatori di condurre immagini rapide di grandi volumi su lunghe sessioni, senza compromettere la risoluzione spaziale o temporale."

Per ricostruire un'immagine multidimensionale, sapere quando ogni fotone colpisce il rivelatore non è sufficiente. È necessario sapere anche da dove ha avuto origine nel cervello. "Questo è ancora più complicato se si desidera semplificare il sistema ed evitare la sincronizzazione dei diversi elementi di scansione, " disse Blinder. "Per fare questo, il nostro software legge un elenco dei tempi di arrivo dei fotoni insieme ai segnali di temporizzazione dagli elementi di scansione, determina l'origine di ciascun fotone all'interno del campione e genera i corrispondenti filmati 3D."

I tempi di arrivo dei fotoni sono generati da un dispositivo noto come digitalizzatore temporale a più eventi, o multiscaler, che registra i tempi con una precisione di 100 picosecondi. Un altro componente chiave era una lente di scansione assiale risonante standard che cambia il piano focale centinaia di migliaia di volte al secondo. Questa lente è stata utilizzata per scansionare rapidamente il raggio laser a diverse profondità all'interno del cervello e ha permesso al team di ricostruire immagini 3D continue.

Più facile, conveniente, imaging 3D continuo

"Il multiscaler che abbiamo usato non è stato applicato al neuroimaging perché l'output non è facile da interpretare, e l'utilizzo di una lente di scansione assiale risonante per il bioimaging ha richiesto un hardware di sincronizzazione della scansione personalizzato o un codice proprietario per ottenere i dati 3D, " ha detto Blinder. "PySight trasforma l'output di entrambi i componenti in un film 3D senza sforzo. Poiché Pysight è un software gratuito e open source, dovrebbe aiutare notevolmente i laboratori precedentemente scoraggiati dall'elevata barriera tecnica che accompagnava l'imaging 3D continuo". avere un'interfaccia applicativa generica, PySight potrebbe anche essere utilizzato per interpretare tempi di rilevamento di fotoni simili da altri dispositivi hardware idonei.

Per verificare se PySight fosse veramente plug and play, i ricercatori hanno camminato con il loro multiscaler in un altro laboratorio di imaging nel campus dell'Università di Tel Aviv. Sono stati in grado di collegare semplicemente il dispositivo al microscopio multifotone esistente, scarica il software PySight e inizia a registrare le risposte agli odori a scia singola nei moscerini della frutta geneticamente modificati per esprimere gli indicatori di tensione. Questa sonda veloce per l'attività neuronale rileva gli aspetti più fini dell'attività neuronale, ma è considerata troppo debole per essere utilizzata senza il conteggio dei fotoni con questo tipo di microscopia. Le funzionalità di PySight aprono la strada a una facile implementazione dell'imaging a tensione multifotonica in quasi tutti i laboratori.

Oltre a continuare a migliorare il software PySight, i ricercatori vorrebbero aggiungere il supporto per altri metodi di imaging microscopico come l'imaging a fluorescenza a vita, che si basa sulla temporizzazione di ciascun fotone rispetto al suo impulso laser originario. Poiché il software è open source e fornisce accesso diretto ai tempi di arrivo dei fotoni, consente ad altri scienziati di aggiungere nuove funzionalità e soddisfare le loro esigenze specifiche.