Il grafico mostra il design di base di un laser a elettroni liberi a raggi X o XFEL, in cui brillanti raffiche di raggi X colpiscono campioni cristallizzati, causando modelli di diffrazione che possono essere riassemblati in immagini dettagliate. I raggi X danneggiano le biomolecole, un problema che ha afflitto gli sforzi di determinazione della struttura per decenni. Ma i lampi di raggi X prodotti da un XFEL sono così brevi, di soli femtosecondi, che la diffusione dei raggi X da una molecola può essere registrata prima che avvenga la distruzione, simile all'utilizzo di un otturatore della fotocamera veloce. (Un femtosecondo è un milionesimo di miliardesimo di secondo, lo stesso rapporto di un secondo è di 32 milioni di anni.) Credito:Shireen Dooling per il Biodesign Institute dell'ASU
La capacità di trasformare la luce solare in energia è una delle imprese più straordinarie della Natura. Gli scienziati comprendono il processo di base della fotosintesi, ma molti dettagli cruciali rimangono sfuggenti, che si verificano a dimensioni e scale temporali fugaci a lungo ritenute troppo minuscole per essere sondate.
Ora, che sta cambiando.
In un nuovo studio, guidato da Petra Fromme e Nadia Zatsepin presso il Biodesign Center for Applied Structural Discovery, la Scuola di Scienze Molecolari e il Dipartimento di Fisica dell'ASU, i ricercatori hanno studiato la struttura del fotosistema I (PSI) con impulsi a raggi X ultracorti presso il laser europeo a elettroni liberi a raggi X (EuXFEL), con sede ad Amburgo, Germania.
PSI è un grande sistema biomolecolare che funge da convertitore di energia solare trasformando l'energia solare in energia chimica. La fotosintesi fornisce energia per tutta la vita complessa sulla Terra e fornisce l'ossigeno che respiriamo. I progressi nel svelare i segreti della fotosintesi promettono di migliorare l'agricoltura e di aiutare nello sviluppo di sistemi di accumulo di energia solare di prossima generazione che combinano l'efficienza della natura con la stabilità dei sistemi ingegnerizzati dall'uomo.
"Questo lavoro è così importante, come mostra la prima prova del concetto di cristallografia seriale megahertz con una delle proteine di membrana più grandi e complesse nella fotosintesi:Photosystem I", afferma Fromme. "Il lavoro apre la strada a studi risolti nel tempo presso l'EuXFEL per determinare i film molecolari di il percorso guidato dalla luce degli elettroni nella fotosintesi o visualizzare come i farmaci antitumorali attaccano le proteine malfunzionanti".
L'EuXFEL, che di recente ha iniziato ad operare, è il primo ad impiegare un acceleratore lineare superconduttore che produce nuove entusiasmanti capacità, tra cui velocità di ripetizione megahertz molto veloci dei suoi impulsi a raggi X, oltre 9000 volte più veloci di qualsiasi altro XFEL, con impulsi separati da meno di 1 milionesimo di secondo. Con questi lampi di luce a raggi X incredibilmente brevi, i ricercatori saranno in grado di registrare molto più rapidamente filmati molecolari di processi biologici fondamentali e avranno probabilmente un impatto su diversi campi tra cui medicina e farmacologia, chimica, fisica, scienza dei materiali, ricerca energetica, studi ambientali, elettronica, nanotecnologia, e fotonica. Petra Fromme e Nadia Zatsepin sono autrici co-corrispondenti del documento, pubblicato nell'ultimo numero della rivista Comunicazioni sulla natura .
Forza nei numeri
Fromme è il direttore del Biodesign Center for Applied Structural Discovery (CASD) e guida gli sforzi del team sperimentale del progetto, mentre Zatsepin ha guidato il team di analisi dei dati XFEL.
"Questa è una pietra miliare significativa nello sviluppo della cristallografia seriale a femtosecondi, basandosi sullo sforzo ben coordinato di un grande, interdisciplinare, team internazionale e anni di sviluppo in campi disparati" sottolinea Zatsepin, ex ricercatore presso il Dipartimento di Fisica e Biodesign CASD dell'ASU, e ora Senior Research Fellow presso la La Trobe University in Australia.
Christopher Gisriel, il co-primo autore dell'articolo, ha lavorato al progetto mentre era ricercatore post-dottorato nel laboratorio Fromme ed è entusiasta del progetto. "La rapida raccolta di dati in esperimenti seriali di cristallografia a femtosecondi rende questa tecnica rivoluzionaria più accessibile a coloro che sono interessati alla relazione struttura-funzione per gli enzimi. Questo è esemplificato dalla nostra nuova pubblicazione in Comunicazioni sulla natura dimostrando che anche le strutture proteiche più difficili e complesse possono essere risolte mediante cristallografia seriale a femtosecondi mentre si raccolgono dati a una velocità di ripetizione di megahertz".
"È molto emozionante vedere il duro lavoro delle tante persone che hanno portato questo progetto a concretizzarsi, "dice Jesse Coe, co-primo autore che si è laureato lo scorso anno con un dottorato di ricerca. in Biochimica dell'ASU. "Questo è un enorme passo nella giusta direzione verso una migliore comprensione del processo di trasferimento di elettroni della natura che è stato perfezionato nel corso di miliardi di anni".
Petra Fromme è la direttrice del Biodesign Center for Applied Structural Discovery (CASD) e guida gli sforzi del team sperimentale del progetto. Credito:Biodesign Institute presso ASU
Scienza estrema
Un XFEL (per laser a elettroni liberi a raggi X) fornisce una luce a raggi X che è un miliardo di volte più luminosa delle sorgenti di raggi X convenzionali. Il brillante, impulsi a raggi X simili a laser sono prodotti da elettroni accelerati quasi alla velocità della luce e alimentati attraverso lo spazio tra le serie di magneti alternati, un dispositivo noto come ondulatore. L'ondulatore costringe gli elettroni a oscillare e a raggrupparsi in pacchetti discreti. Ciascuno dei grappoli di elettroni oscillanti perfettamente sincronizzati emette un potente, breve impulso di raggi X lungo il percorso di volo degli elettroni.
Nella cristallografia seriale a femtosecondi, un getto di cristalli proteici viene iniettato nel percorso del raggio XFEL pulsato a temperatura ambiente, fornendo informazioni strutturali sotto forma di modelli di diffrazione. Da questi schemi, gli scienziati possono determinare immagini su scala atomica di proteine in condizioni simili a quelle native, aprendo la strada a filmati molecolari accurati delle molecole al lavoro.
I raggi X danneggiano le biomolecole, un problema che ha afflitto per decenni gli sforzi di determinazione della struttura, richiedendo il congelamento delle biomolecole per limitare il danno. Ma i lampi di raggi X prodotti da un XFEL sono così brevi, della durata di pochi femtosecondi, che la diffusione dei raggi X da una molecola può essere registrata prima che avvenga la distruzione, simile all'utilizzo di un otturatore della fotocamera veloce. Come punto di riferimento un femtosecondo è un milionesimo di miliardesimo di secondo, lo stesso rapporto di un secondo è di 32 milioni di anni.
A causa della raffinatezza, dimensione e costo delle strutture XFEL, solo cinque sono attualmente disponibili per tali esperimenti in tutto il mondo, un grave collo di bottiglia per i ricercatori poiché ogni XFEL in genere può ospitare solo un esperimento alla volta. La maggior parte degli XFEL genera impulsi a raggi X tra 30 e 120 volte al secondo e possono essere necessarie diverse ore o giorni per raccogliere i dati necessari per determinare una singola struttura, figuriamoci una serie di fotogrammi in un film molecolare. L'EuXFEL è il primo ad impiegare un acceleratore lineare superconduttore nella sua progettazione, consentendo la più rapida successione di impulsi a raggi X di qualsiasi XFEL, che può ridurre significativamente il tempo necessario per determinare ogni struttura o fotogramma del film.
Alto rischio, alta ricompensa
Poiché il campione viene cancellato dagli intensi impulsi di raggi X, deve essere reintegrato in tempo per il successivo impulso a raggi X, che richiedeva che i cristalli PSI fossero consegnati 9000 volte più velocemente all'EuXFEL rispetto ai precedenti XFEL, a una velocità del getto di circa 50 metri al secondo (160 piedi al secondo), come una manichetta antincendio microfluidica. Questo è stato difficile in quanto richiede grandi quantità della preziosa proteina contenuta all'interno di cristalli uniformi per raggiungere queste alte velocità del getto ed evitare di bloccare il sistema di erogazione del campione. Le grandi proteine di membrana sono così difficili da isolare, cristallizzare e consegnare al raggio, che non si sapeva se questa importante classe di proteine potesse essere studiata all'EuXFEL.
Il team ha sviluppato nuovi metodi che hanno permesso a PSI, che è un grande complesso costituito da 36 proteine e 381 cofattori, che comprendono le 288 clorofille (i pigmenti verdi che assorbono la luce) e ne ha oltre 150, 000 atomi ed è oltre 20 volte più grande delle precedenti proteine studiate all'EuXFEL, per avere la sua struttura determinata a temperatura ambiente con una notevole risoluzione di 2,9 angstrom, una pietra miliare significativa.
Miliardi di microcristalli della proteina di membrana PSI, derivato da cianobatteri, doveva essere cresciuto per il nuovo studio. Era necessaria una rapida crescita dei cristalli dai semi di nanocristalli per garantire l'uniformità essenziale della dimensione e della forma dei cristalli. PSI è una proteina di membrana, che è una classe di proteine di grande importanza che sono state notoriamente difficili da caratterizzare. Le loro strutture elaborate sono incorporate nel doppio strato lipidico della membrana cellulare. Tipicamente, devono essere accuratamente isolati in forma pienamente attiva dal loro ambiente nativo e trasformati in uno stato cristallino, dove le molecole si impacchettano in cristalli ma mantengono tutta la loro funzione nativa.
Nel caso del PSI, questo si ottiene estraendolo con detergenti molto delicati che sostituiscono la membrana e circondano la proteina come una camera d'aria di una piscina, che imita l'ambiente della membrana nativa e mantiene PSI completamente funzionale una volta che è imballato all'interno dei cristalli. Quindi, quando i ricercatori illuminano i pigmenti verdi (clorofille) che catturano la luce dal sistema di antenne del PSI, l'energia viene utilizzata per sparare un elettrone attraverso la membrana.
Nadia Zatsepin, ex ricercatore presso il Dipartimento di Fisica e Biodesign CASD dell'ASU, è ora Senior Research Fellow presso la La Trobe University in Australia. Credito:Biodesign Institute presso ASU
Per mantenere il PSI completamente funzionante, i cristalli sono solo debolmente impaccati contenenti il 78% di acqua, il che li rende morbidi come un pezzo di burro al sole e rende difficile maneggiare questi fragili cristalli. "Isolare, caratterizzare e cristallizzare un grammo di PSI, o un miliardo di miliardi di molecole di PSI, perché gli esperimenti nella loro forma completamente attiva è stato un enorme sforzo da parte degli studenti e dei ricercatori del mio team", afferma Fromme." Nel futuro, con tassi di ripetizione ancora più elevati e nuovi sistemi di consegna del campione, il consumo del campione sarà drasticamente ridotto".
La registrazione e l'analisi dei dati di diffrazione è stata un'altra sfida. Un rivelatore di raggi X unico è stato sviluppato da EuXFEL e DESY per gestire le esigenze degli studi di biologia strutturale presso l'EuXFEL:il rivelatore di pixel a guadagno adattivo integrato, o AGIPD. Ciascuno dei 1 milione di pixel di AGIPD ha una larghezza inferiore a un centesimo di pollice e contiene 352 celle di memoria analogiche, che consentono all'AGIPD di raccogliere dati a velocità di megahertz su un ampio intervallo dinamico. Però, per raccogliere dati cristallografici accurati da microcristalli di grandi proteine di membrana è stato necessario un compromesso tra risoluzione spaziale e campionamento dei dati.
"Spingere per una raccolta di dati a risoluzione più elevata con l'attuale dimensione del rilevatore potrebbe precludere l'elaborazione utile dei dati cristallografici perché i punti di diffrazione non sono sufficientemente risolti dai pixel del rilevatore di raggi X", avverte Zatsepin, "tuttavia in termini di velocità di trasmissione dati e gamma dinamica, quello di cui è capace l'AGIPD è incredibile".
Il nuovo software per la riduzione dei dati e l'analisi cristallografica progettato specificamente per affrontare le sfide uniche per i massicci set di dati nella cristallografia XFEL, il cui sviluppo è stato guidato dai collaboratori di CFEL, DESY, e ASU, hanno fatto molta strada dal primo esperimento XFEL ad alta risoluzione nel 2011.
"Il nostro software e le capacità di elaborazione ad alte prestazioni di DESY vengono davvero messi alla prova con i volumi di dati senza precedenti generati all'EuXFEL. È sempre emozionante spingere i limiti della tecnologia all'avanguardia, " aggiunge Zatsepin.
Proteine di membrana:floppy, ancora formidabile
Le proteine di membrana come la PSI, così chiamate perché sono incorporate nelle membrane cellulari, sono vitali per tutti i processi vitali, compresa la respirazione, funzione nervosa, assorbimento nutrizionale, e segnalazione cellula-cellula. Poiché si trovano sulla superficie di ogni cellula, sono anche i più importanti bersagli farmaceutici. Più del 60% di tutti i farmaci attuali è mirato alle proteine di membrana. La progettazione di farmaci più efficaci con minori effetti collaterali è quindi subordinata alla comprensione di come particolari farmaci si legano alle loro proteine bersaglio e alle loro conformazioni strutturali altamente dettagliate e attività dinamiche.
Nonostante la loro enorme importanza in biologia, le strutture proteiche di membrana costituiscono meno dell'1% di tutte le strutture proteiche risolte fino ad oggi perché sono notoriamente difficili da isolare, caratterizzare e cristallizzare. Questo è il motivo per cui importanti progressi nei metodi cristallografici, come l'avvento della cristallografia seriale a femtosecondi dei megahertz delle proteine di membrana, avranno senza dubbio un impatto significativo sulla comunità scientifica.
Ci vuole un villaggio
Questi recenti risultati non sarebbero possibili senza lo sforzo instancabile di un team dedicato di quasi 80 ricercatori provenienti da 15 istituzioni, compreso ASU, l'XFEL europeo, DESY, il Centro per la scienza dei raggi X ultraveloci, Istituto Hauptman-Woodward, SUNY Bufalo, SLAC, Università di Amburgo, Università di Gottinga, Accademia Ungherese delle Scienze, Università del Tennessee, Laboratorio Nazionale Lawrence Livermore, Università di Southampton, Università di tecnologia di Amburgo, Università del Wisconsin. Il gruppo di ricerca includeva collaboratori statunitensi nel NSF BioXFEL Science and Technology Center e un gruppo di collaboratori internazionali, tra cui Adrian P. Mancuso e Romain Letrun, scienziati a capo della linea di luce EuXFEL e Oleksandr Yefanov e Anton Barty di CFEL/DESY che hanno lavorato a stretto contatto con il team dell'ASU sulla complessa analisi dei dati.