Il dispositivo CFM da banco, costituito dall'unità CFM stessa (in alto), parti per la trasmissione del segnale della fotocamera e una batteria (a destra), si inserisce in due cestelli standard di una comune centrifuga da laboratorio che sono bilanciati da contrappesi nei rispettivi cestelli opposti. Credito:Wyss Institute presso l'Università di Harvard.
Dalla tensione delle fibre muscolari in contrazione agli stress idrodinamici all'interno del sangue che scorre, le molecole all'interno del nostro corpo sono soggette a un'ampia varietà di forze meccaniche che influenzano direttamente la loro forma e funzione. Analizzando le risposte delle singole molecole in condizioni in cui sperimentano tali forze, possiamo sviluppare una migliore comprensione di molti processi biologici, e potenzialmente, sviluppare farmaci ad azione più accurata. Ma fino ad ora l'analisi sperimentale delle interazioni di singole molecole sotto forza è stata costosa, noioso e difficile da eseguire perché richiede l'uso di attrezzature sofisticate, come un microscopio a forza atomica o pinzette ottiche, che consentono solo l'analisi di una molecola alla volta.
Ora, un gruppo di ricerca guidato da Wesley Wong presso il Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering di Harvard e il Boston Children's Hospital ha fatto un grande progresso sviluppando un metodo poco costoso che consente l'analisi simultanea delle risposte di forza di migliaia di molecole simili. riferiscono in Comunicazioni sulla natura come i nanointerruttori di DNA programmabili possono essere utilizzati in combinazione con un microscopio a forza centrifuga (CFM) miniaturizzato di nuova concezione come strumento altamente affidabile per osservare migliaia di singole molecole e le loro risposte alle forze meccaniche in parallelo.
"Questo nuovo approccio combinato consentirà a noi e ad altri di esaminare come si comportano i complessi di singole molecole quando vengono espulsi dal loro equilibrio dalla forza sintonizzabile generata nel nostro CFM di nuova concezione. Basando questo strumento su qualcosa che la maggior parte dei ricercatori già possiede e usa— la centrifuga da banco:speriamo di rendere le misurazioni della forza di singole molecole accessibili a quasi tutti, " ha detto Wong, dottorato di ricerca, che è un membro della facoltà associata del Wyss Institute e autore senior dello studio. È anche Assistant Professor presso la Harvard Medical School nei Dipartimenti di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare e Pediatria, e ricercatore nel programma in medicina cellulare e molecolare presso il Boston Children's Hospital.
L'immagine in alto mostra un nanoswitch di DNA che forma una struttura ad anello quando si forma un legame tra i componenti reattivi attaccati (ad esempio la coppia recettore-ligando mostrata in rosso e verde); da un lato è attaccato al tavolino del campione e dall'altro a un cordone (in alto). Applicando forze centrifughe al tallone nel dispositivo CFM, il legame tra i componenti reattivi può essere ripetutamente rotto, aprendo l'ansa e aumentando la lunghezza del legame del DNA (in basso), consentendo misurazioni altamente affidabili delle interazioni molecolari. Nel CFM, molte perline possono essere interrogate in parallelo, consentendo misurazioni di singole molecole ad alto rendimento (in basso a sinistra). Nel video in basso a destra, la fotocamera cattura questi eventi di rottura in tempo reale registrando il tallone in un punto diverso. Credito:Wyss Institute presso l'Università di Harvard.
I primi sforzi guidati da Wong presso il Rowland Institute di Harvard hanno introdotto il primo CFM nel 2010, che era uno strumento altamente specializzato che effettuava misurazioni di forza di precisione ad alto rendimento su singole molecole legandole a perline e tirandole usando la forza centrifuga. Nella sua ultima iterazione CFM, Wong e il suo team hanno sviluppato un modo per eseguire la stessa tecnica con precisione simile utilizzando un piccolo microscopio economico realizzato con elementi facili da assemblare e parti stampate in 3D che possono essere inserite nel secchio oscillante di una centrifuga da banco standard che si trova praticamente in tutti laboratori di ricerca biomedica.
Inoltre, il team ha aumentato la robustezza e l'accuratezza del test integrando migliaia di cosiddetti nanointerruttori del DNA, filamenti di DNA lineari con coppie di molecole interagenti che sono associate a due sequenze nel mezzo e che, Inoltre, legandosi tra loro creano un anello di DNA interno; le estremità dei nanoswitch sono legate alla superficie del campione da un lato e alle perline dall'altro.
"Applicando una gamma definita di forze centrifughe alle perline possiamo provocare la rottura dei complessi molecolari che generano le strutture del DNA ad anello che verranno registrate dall'obiettivo accoppiato alla fotocamera. È importante sottolineare che l'utilizzo di nanointerruttori di DNA come impalcatura stabile ci consente di ripetere questo processo più volte con la stessa molecola in condizioni di temperatura controllata, il che migliora notevolmente la nostra precisione nel determinare l'eterogeneità che può mostrare una singola interazione molecolare, " ha detto Darren Yang, il primo autore dello studio e uno studente laureato nel team di Wong.
Nelle ricerche future, i nanointerruttori di DNA associati alle perline possono essere impiegati per assemblare e rompere ripetutamente molti diversi complessi biomolecolari e per definire le forze meccaniche che li controllano. "I nanointerruttori di DNA integrati sono molto modulari, e può essere funzionalizzato con molte biomolecole diverse essenzialmente in modo plug-and-play, per consentire un'ampia varietà di interazioni molecolari da studiare con elevata produttività e affidabilità, " ha aggiunto Wong.
Prossimo, gli scienziati di Wyss stanno progettando di applicare il loro CFM in miniatura potenziato con nanoswitch di DNA allo studio di interazioni molecolari biomediche rilevanti e dipendenti dalla forza, come le interazioni proteiche che regolano la coagulazione del sangue o l'udito.
"Il team di Wong ha creato una nuova piattaforma tecnologica che riduce notevolmente il costo dell'analisi della forza di una singola molecola e la rende ampiamente accessibile alla comunità scientifica. Oltre ad aumentare la nostra comprensione delle relazioni di base struttura-funzione molecolare, può rivelarsi uno strumento prezioso per lo sviluppo di farmaci, ", ha affermato il direttore fondatore del Wyss Institute, Donald Ingber, M.D., dottorato di ricerca, che è anche Judah Folkman Professor of Vascular Biology presso la Harvard Medical School e il programma di Vascular Biology presso il Boston Children's Hospital, e Professore di Bioingegneria presso SEAS.
