I ricercatori della McKelvey School of Engineering della Washington University di St. Louis hanno aperto la strada a una nuova tecnica che consentirà l'imaging ad alta risoluzione di oggetti molto piccoli come i neuroni. La tecnica, che migliora un metodo esistente chiamato microscopia ad espansione, è descritta in un nuovo articolo pubblicato sulla rivista Nano Letters .

La maggior parte delle persone ha familiarità con i microscopi che utilizzano lenti per far apparire un oggetto più grande e più facile da vedere con l'occhio umano. Ma la microscopia ad espansione (ExM) funziona praticamente in modo opposto, ingrandendo l’oggetto stesso. Gli scienziati rivestono il campione, ad esempio una cellula, con minuscoli marcatori che emettono luce chiamati fluorofori, quindi incorporano il campione all'interno di un gel che si espande quando entra in contatto con l'acqua. Man mano che il campione diventa più grande, le etichette fluorescenti tracciano i contorni di caratteristiche troppo piccole per essere viste, come i rami sottili, o dendriti, che crescono dalle cellule cerebrali.

Ma la microscopia ad espansione ha un grosso limite. Il segnale luminoso emesso dai fluorofori convenzionali perde gran parte della sua intensità (più del 50%) durante le fasi di preparazione ed espansione.

"Quando si ingrandiscono le cose, non è necessariamente positivo, perché se non si modifica la quantità di segnale già presente, quel segnale diventa più debole", ha affermato Barani Raman, professore di ingegneria biomedica.

Raman e Srikanth Singamaneni, professori di Lilyan &E. Lisle Hughes presso il Dipartimento di Ingegneria Meccanica e Scienza dei Materiali, hanno affrontato questo problema utilizzando marcatori fluorescenti ultraluminosi chiamati fluori plasmonici (PF). Singamaneni ha sviluppato i PF per altre applicazioni nel 2020.

"È un bell'esempio di due persone con competenze completamente diverse che hanno una conversazione casuale e dicono:"Okay, questo problema è qui in un campo, ma la soluzione è lì in un altro campo", ha detto Raman. Il team ha soprannominato la sua nuova tecnica "microscopia ad espansione potenziata dal plasmone" o p-ExM.

Il fluoro plasmonico è costituito da un nucleo di particelle d'oro avvolto in un guscio d'argento, che viene poi ricoperto con uno strato di altri materiali, inclusi fluorofori convenzionali. La struttura è progettata per proteggere i fluorofori dalle sostanze chimiche aggressive utilizzate nel processo e per rendere il segnale luminoso proveniente dai fluorofori molto più luminoso. La tecnica aiuterà i ricercatori a mappare le reti neurali o le connessioni tra neuroni.

"La nanoparticella metallica funge da antenna, il che significa che è in grado di attirare più luce nei fluorofori", ha detto Singamaneni. L’interazione tra la nanoparticella oro-argento e i fluorofori fa sì che i fluorofori emettano più fotoni di quanto farebbero normalmente. Di conseguenza, il fluor plasmonico è quasi quattro ordini di grandezza più luminoso di quanto lo sarebbero i marcatori fluorescenti presi singolarmente. I fluori plasmonici risolvono anche il problema della diluizione del segnale perché i marcatori fluorescenti sono attaccati direttamente alla nanoparticella, quindi non si diffondono quando il campione si espande.

Per dimostrare il potenziale della microscopia ad espansione potenziata dal plasmone, i ricercatori l'hanno usata per studiare un campione di neuroni della regione dell'ippocampo del cervello. In alcuni casi, i rami in erba del neurone, chiamati neuriti, sono troppo vicini l'uno all'altro per poterli distinguere senza l'aiuto di tecniche come la microscopia ad espansione.

"Quando due neuriti sono troppo vicini tra loro, non possiamo risolverli. Il software pensa che siano solo un neurite", ha detto Singamaneni.

Dopo aver etichettato le cellule con fluori plasmonici ultraluminosi ed aver espanso il campione, il team è stato in grado di contare il numero di neuriti, quantificare l'area totale dei neuriti e misurare la lunghezza dei singoli neuriti. Hanno identificato 2,5 volte più punti terminali dei neuriti di quelli visibili prima che il campione fosse espanso.

Quando il team ha confrontato le prestazioni del fluor plasmonico con quelle dei fluorofori stessi, ha scoperto che il fluor plasmonico conservava circa il 76% del segnale luminoso mentre i fluorofori ne trattenevano meno del 16%. I risultati del team hanno anche mostrato che la microscopia ad espansione potenziata dal plasmone è compatibile con i protocolli di microscopia ad espansione esistenti, il che significa che i fluori plasmonici possono essere utilizzati al posto dei fluorofori convenzionali negli studi futuri. I PF possono anche essere creati da qualsiasi fluoroforo adatto alle esigenze dei ricercatori.

Ulteriori informazioni: Priya Rathi et al, Microscopia di espansione potenziata dal plasmone, Nano lettere (2023). DOI:10.1021/acs.nanolett.3c01256

Informazioni sul giornale: Nanolettere

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