La clonazione molecolare è un metodo biotecnologico comune che ogni studente e ricercatore dovrebbe conoscere. La clonazione molecolare usando un tipo di enzima chiamato un enzima di restrizione per tagliare il DNA umano in frammenti che possono quindi essere inseriti nel DNA plasmidico di una cellula batterica. Gli enzimi di restrizione hanno dimezzato il DNA a doppio filamento. A seconda dell'enzima di restrizione, il taglio può provocare un'estremità appiccicosa o smussata. Le estremità adesive sono più utili nella clonazione molecolare perché assicurano che il frammento di DNA umano sia inserito nel plasmide nella giusta direzione. Il processo di legatura o fusione dei frammenti di DNA richiede meno DNA quando il DNA ha estremità appiccicose. Infine, più enzimi di restrizione dell'estremità appiccicosa possono produrre la stessa estremità appiccicosa, anche se ciascun enzima riconosce una diversa sequenza di restrizione. Ciò aumenta la probabilità che la tua regione di DNA di interesse possa essere eliminata dagli enzimi terminali appiccicosi.
Enzimi di restrizione e siti di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono enzimi che riducono il riconoscimento di sequenze specifiche sul DNA a doppio filamento e riducono il DNA a metà in quella sequenza. La sequenza riconosciuta si chiama il sito di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono chiamati endonucleasi perché tagliano il DNA a doppio filamento, che è come il DNA normalmente esiste, in posizioni che si trovano tra le estremità del DNA. Esistono più di 90 diversi enzimi di restrizione. Ciascuno riconosce un sito di restrizione distinto. Gli enzimi di restrizione dividono i loro rispettivi siti di restrizione 5.000 volte più efficacemente di altri siti che non riconoscono.
Il giusto orientamento
Gli enzimi di restrizione rientrano in due classi generali. O tagliano il DNA in estremità appiccicose o smussate. Un'estremità appiccicosa ha una breve regione di nucleotidi, i mattoni del DNA, che non è accoppiata. Questa regione spaiata è chiamata una sporgenza. Si dice che lo sbalzo sia appiccicoso perché vuole e si accoppierà con un'altra estremità appiccicosa che ha una sequenza di sbalzo complementare. Le estremità appiccicose sono come gemelli perduti da tempo che cercano di abbracciarsi strettamente quando si incontrano. D'altra parte, le estremità smussate non sono appiccicose perché tutti i nucleotidi sono già accoppiati tra i due filamenti di DNA. Il vantaggio delle estremità appiccicose è che un frammento di DNA umano può inserirsi in un plasmide batterico solo in una direzione. Al contrario, se sia il DNA umano che il plasmide batterico hanno estremità smussate, il DNA umano può essere inserito testa a coda o coda a testa nel plasmide.
Ligare le estremità appiccicose richiede meno DNA
Sebbene il DNA con le estremità del bastone abbia un tempo più facile trovarsi l'un l'altro a causa della loro "viscosità", né le estremità appiccicose né le estremità smussate possono fondersi in un pezzo continuo di DNA. La formazione di un pezzo continuo di DNA completamente collegato richiede un enzima chiamato ligasi. Le ligasi collegano le ossa posteriori dei nucleotidi alle estremità appiccicose o smussate, risultando in una catena continua di nucleotidi. Poiché le estremità appiccicose si trovano più rapidamente a causa della loro attrazione reciproca, il processo di legatura richiede meno DNA umano e meno DNA plasmidico. Le estremità smussate del DNA e dei plasmidi hanno meno probabilità di trovarsi, e quindi la legatura delle estremità smussate richiede che più DNA venga immesso nella provetta.
Enzimi diversi possono dare la stessa estremità appiccicosa
Restrizione i siti si trovano in tutto il genoma degli organismi, ma non sono distribuiti uniformemente. Nei plasmidi, possono essere progettati per essere posizionati uno accanto all'altro. Gli scienziati che vogliono ritagliare un frammento di DNA umano dal genoma umano devono trovare siti di restrizione che si trovano davanti e dietro la regione del frammento. Oltre a garantire che un frammento di DNA sia inserito nella giusta direzione, diversi enzimi appiccicosi possono creare la stessa estremità appiccicosa anche se riconoscono sequenze di restrizione diverse. Ad esempio, BamHI, BglII e Sau3A hanno sequenze di riconoscimento diverse ma producono la stessa estremità adesiva GATC. Ciò aumenta la probabilità che ci siano siti di restrizione appiccicosi che fiancheggiano il tuo gene umano di interesse.
