Secondo il sito Web BioWeb dell'Università del Wisconsin, un primer per PCR è un breve oligonucleotide sintetico (di solito tra 18 e 25 basi) usato per amplificare specifiche regioni del DNA in una tecnica di biologia molecolare nota come reazione a catena della polimerasi (PCR) . Sono necessari sia un primer diretto che uno reverse, progettati per essere complementi inversi del filamento di DNA, per fiancheggiare e legarsi alla regione di DNA desiderata. Quando gli scienziati vogliono eseguire ricerche su uno specifico gene o regione di DNA, devono prima eseguire la PCR per acquisire una quantità sufficiente della regione target con cui lavorare. La progettazione di sequenze di primer per la regione di interesse può essere necessaria se non sono già disponibili attraverso ricerche precedentemente pubblicate o con mezzi commerciali.
Ottenere la sequenza nucleotidica del gene o regione di interesse del DNA e decidere per quanto tempo un frammento desideri amplificare. Il primer avanti e indietro è progettato per legarsi all'inizio e alla fine del frammento desiderato. In genere, i metodi convenzionali di PCR utilizzano primer che fiancheggiano una regione compresa tra 100 e 1.000 paia di basi, mentre i metodi PCR in tempo reale utilizzano frammenti lunghi da 50 a 200 paia di basi.
Decidi dove nella sequenza desideri i primer mentire. Ad esempio, potresti volere la posizione vicino all'estremità 5 'o 3' della sequenza o nel mezzo. Se lo si desidera, designare la posizione dei primer su un introne.
Seguire le linee guida raccomandate per la progettazione del primer. Il successo dell'amplificazione del prodotto del DNA dipende dalla qualità dei primer e alcune variabili sono fondamentali.
I primer del progetto devono avere una lunghezza compresa tra 18 e 24 basi. Vincent R. Prezioso, Ph.D., di Brinkmann Instruments Inc., suggerisce che questa lunghezza è abbastanza lunga da essere estremamente specifica per la regione di DNA desiderata, ma abbastanza breve da legarsi (annealing) facilmente. La temperatura di fusione del primer (Tm) deve essere compresa tra 55 e 80 gradi Celsius, sufficientemente bassa da consentire la fusione completa a temperature superiori o superiori a 90 gradi Celsius, ma sufficientemente elevata da consentire la ricottura. Il contenuto del GC (percentuale di G e C nella sequenza) dovrebbe essere tra il 40 e il 60 percento. L'estremità 3 'della sequenza di primer dovrebbe terminare in un C o in un G (chiamato un morsetto GC) per promuovere il legame, poiché i nucleotidi G e C hanno legami più forti, tuttavia, evitare di avere tre o più G o C negli ultimi cinque basi della sequenza.
Evitare di eseguire quattro o più basi (come ACCCC ...) o quattro o più ripetizioni di nucleotide (come ATATATAT ...) perché possono causare errori di digitazione. Primer di progettazione senza omologia intra-primer (più di tre basi che si integrano all'interno del primo primer stesso) o omologia inter-primer (dove il primer forward e reverse hanno sequenze complementari). Questo può causare auto-dimeri o primer-dimeri, dove i primer si legano a se stessi invece di legarsi alla sequenza di DNA desiderata.
Utilizzare risorse online e siti Web che aiutano nella progettazione di primer o aiutano a controllare le sequenze di primer per auto- complementarità o la possibilità di costruire strutture secondarie come le forcine per capelli. Alcuni siti Web di progettazione di primer includono Primer3 del Massachusetts Institute of Technology, OligoAnalyzer del Centro nazionale per le informazioni biologiche e Primer-Blast e Integrated DNA Technologies.
