La clonazione molecolare è un metodo biotecnologico comune che ogni studente e ricercatore dovrebbe avere familiarità con. Clonazione molecolare utilizzando un tipo di enzima chiamato enzima di restrizione per tagliare il DNA umano in frammenti che possono quindi essere inseriti nel DNA plasmidico di una cellula batterica. Gli enzimi di restrizione tagliano a metà il DNA a doppio filamento. A seconda dell'enzima di restrizione, il taglio può risultare in una estremità appiccicosa o una estremità smussata. Le estremità appiccicose sono più utili nella clonazione molecolare perché garantiscono che il frammento di DNA umano sia inserito nel plasmide nella giusta direzione. Il processo di legatura o fusione di frammenti di DNA richiede meno DNA quando il DNA ha estremità adesive. Infine, più enzimi di restrizione dell'estremità appiccicosa possono produrre la stessa estremità appiccicosa, anche se ciascun enzima riconosce una diversa sequenza di restrizione. Ciò aumenta la probabilità che la regione di interesse del DNA possa essere tagliata dagli enzimi appiccicosi.
Siti di enzimi e restrizione di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono enzimi che tagliano le sequenze specifiche sul DNA a doppio filamento e taglia il DNA a metà in quella sequenza. La sequenza riconosciuta è chiamata il sito di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono chiamati endonucleasi perché tagliano il DNA a doppio filamento, che è il modo in cui normalmente il DNA esiste, in posizioni che si trovano tra le estremità del DNA. Esistono più di 90 diversi enzimi di restrizione. Ciascuno riconosce un sito di restrizione distinto. Gli enzimi di restrizione scindono i rispettivi siti di restrizione in modo 5.000 volte più efficiente di altri siti che non riconoscono.
L'orientamento corretto
Gli enzimi di restrizione sono disponibili in due classi generali. Tagliano il DNA in estremità appiccicose o estremità smussate. Un'estremità appiccicosa ha una breve regione di nucleotidi, i blocchi costitutivi del DNA, che non è stata accoppiato. Questa regione spaiata è chiamata strapiombo. Si dice che lo strapiombo sia appiccicoso perché vuole e si accoppierà con un'altra estremità appiccicosa che ha una sequenza di sbalzo complementare. Le estremità appiccicose sono come gemelli perduti da tempo che cercano di abbracciarsi strettamente una volta incontrati. D'altra parte, le estremità smussate non sono appiccicose perché tutti i nucleotidi sono già accoppiati tra i due filamenti di DNA. Il vantaggio delle estremità appiccicose è che un frammento di DNA umano può adattarsi solo a un plasmide batterico in una direzione. Al contrario, se sia il DNA umano che il plasmide batterico hanno estremità smussate, il DNA umano può essere inserito dalla testa alla coda o dalla coda alla testa nel plasmide.
Estremità adesiva legante Richiede meno DNA
Sebbene il DNA con estremità stecco abbia un tempo più facile trovarsi l'un l'altro a causa della loro "viscosità", né le estremità appiccicose né le estremità smussate possono fondersi insieme in un pezzo continuo di DNA. La formazione di un pezzo continuo di DNA completamente collegato richiede un enzima chiamato ligasi. I ligasi collegano le spine dorsali dei nucleotidi alle estremità appiccicose o smussate, risultando in una catena continua di nucleotidi. Poiché le estremità appiccicose si trovano più velocemente a causa della loro attrazione reciproca, il processo di legatura richiede meno DNA umano e meno DNA plasmidico. Le estremità smussate del DNA e dei plasmidi hanno meno probabilità di trovarsi l'un l'altra, e quindi la legatura delle estremità smussate richiede che più DNA venga inserito nella provetta.
Enzimi diversi possono dare la stessa fine appiccicosa
I siti di restrizione si trovano in tutto il genoma degli organismi, ma non sono equamente distribuiti. Nei plasmidi, possono essere progettati per essere posizionati uno accanto all'altro. Gli scienziati che vogliono ritagliare un frammento di DNA umano dal genoma umano devono trovare siti di restrizione che si trovano nella parte anteriore e posteriore della regione del frammento. Oltre a garantire che un frammento di DNA sia inserito nella giusta direzione, i diversi enzimi appiccicosi possono creare la stessa estremità appiccicosa anche se riconoscono diverse sequenze di restrizione. Ad esempio, BamHI, BglII e Sau3A hanno sequenze di riconoscimento diverse ma producono la stessa estremità adesiva GATC. Ciò aumenta la probabilità che ci siano siti di restrizione dell'estremità appiccicosa che fiancheggiano il tuo gene umano di interesse.
