- Ingresso:dati RNA-seq a cella singola (matrice di conteggio)

- Controllo qualità (QC):rimuovere cellule e geni di bassa qualità

- Normalizzazione dei dati:normalizza i dati per correggere errori tecnici

2. Clustering

- Eseguire il clustering sui dati normalizzati per identificare i cluster di celle

- È possibile utilizzare diversi metodi di clustering (ad esempio, k-mean, clustering gerarchico, Louvain)

3. Identificazione del gene marcatore

- Per ogni cluster:

- Calcolare l'espressione media di ciascun gene nelle cellule del cluster

- Confrontare l'espressione media dei geni nel cluster con quella di altri cluster

- Identificare i geni che sono altamente espressi nel cluster rispetto ad altri cluster

4. Convalida del gene marcatore

- È possibile applicare criteri aggiuntivi per selezionare i geni marcatori:

- Fold change:considera i geni con un elevato fold change tra il cluster e altri cluster

- Significatività statistica:utilizzare test statistici (ad esempio, t-test, test di Wilcoxon) per valutare la significatività delle differenze di espressione

- Specificità:garantire che i geni marcatori siano espressi selettivamente nel cluster di interesse

5. Interpretazione e visualizzazione

- Analizzare le funzioni e i percorsi associati ai geni marcatori identificati

- Genera mappe di calore, grafici dei vulcani o altre visualizzazioni per presentare i geni marcatori e i loro modelli di espressione

6. Convalida in set di dati indipendenti (facoltativo)

- Per aumentare la fiducia, convalidare i geni marcatori identificati in un set di dati indipendente, se disponibile.