1. Marcatori di resistenza agli antibiotici:
* Principio: Questo metodo si basa sull'inserimento di un gene di resistenza agli antibiotici insieme al gene desiderato nel vettore. Le cellule che occupano con successo il vettore ricombinante acquisiranno anche resistenza all'antibiotico specifico.
* Procedura: Le cellule sono coltivate su media contenenti l'antibiotico. Solo le cellule che hanno ripreso il vettore ricombinante ed esprimono il gene della resistenza sopravviveranno e formeranno colonie.
* Esempio: Il gene comune di resistenza all'ampicillina (AMPR) consente ai batteri di sopravvivere in presenza di ampicillina.
2. Geni reporter:
* Principio: I geni reporter codificano proteine che producono un segnale rilevabile, consentendo una facile identificazione delle cellule contenenti il DNA ricombinante.
* Procedura: I geni reporter sono spesso legati al gene desiderato, quindi l'espressione del gene reporter indica un successo di inserimento del DNA ricombinante.
* Esempi:
* Gene lacz: Codifica beta-galattosidasi, che scompone un substrato (X-gal) per produrre un colore blu.
* Geni GFP: Codifica la proteina fluorescente verde, che rende le cellule che si illuminano verde UV.
3. Selezione del colore:
* Principio: Questo metodo utilizza un sistema genetico in cui la presenza del DNA ricombinante cambia il colore delle cellule.
* Procedura: Le cellule contenenti il DNA ricombinante mostreranno un colore diverso rispetto alle cellule senza di esso.
* Esempio: Il metodo di screening blu-bianco utilizza un vettore con il gene LACZ interrotto dal sito di inserimento per il DNA ricombinante. Le cellule con DNA ricombinante produrranno colonie bianche, mentre le cellule senza di essa produrranno colonie blu.
4. Complementazione:
* Principio: Questo metodo viene utilizzato quando il gene desiderato è necessario affinché la cellula sopravviva o produca un prodotto specifico.
* Procedura: Le cellule prive di un gene funzionale si trasformano con il vettore ricombinante contenente il gene. Solo le cellule con il gene funzionale sopravviveranno o produrranno il prodotto desiderato.
* Esempio: Un ceppo di batteri privi di un enzima specifico può essere trasformato con un vettore contenente il gene che codifica l'enzima. Solo i batteri trasformati saranno in grado di sopravvivere e crescere.
5. Fluorescenza Activated Cell Ordining (FACS):
* Principio: FACS utilizza l'etichettatura della fluorescenza per identificare e ordinare le cellule in base a caratteristiche specifiche.
* Procedura: Le cellule che esprimono il gene desiderato (collegato a un marcatore fluorescente) sono ordinate dal resto in base alle loro proprietà di fluorescenza.
* Vantaggi: Screening ad alto rendimento, separazione precisa e ordinamento efficiente delle cellule.
6. Screening PCR:
* Principio: La PCR può essere utilizzata per amplificare una sequenza specifica del DNA, confermando la presenza del DNA ricombinante.
* Procedura: Il DNA viene estratto dalle cellule e amplificato usando primer specifici per il gene inserito. La presenza del prodotto amplificato indica un inserimento riuscito.
La scelta del metodo di selezione dipende dall'esperimento specifico, dal vettore utilizzato e dal risultato desiderato.
