1. Costruire un vettore di trasformazione: Viene creato un vettore contenente il gene desiderato, insieme a sequenze che promuovono l'integrazione nel genoma dei cloroplasti. Questo vettore di solito include un gene marker selezionabile per identificare le cellule trasformate.
2. Fornire il vettore in cloroplasti: Esistono due metodi principali per consegnare il vettore in cloroplasti:
* Trasformazione biolistica: Questo metodo utilizza una pistola genica per sparare in oro microscopico o particelle di tungsteno rivestite con il vettore di trasformazione in cellule vegetali.
* Trasformazione mediata da Agrobacterium: Questo metodo utilizza il batterio * Agrobacterium tumefaciens * per consegnare il vettore in cloroplasti. * Agrobacterium* infetta naturalmente le piante e integra il proprio DNA nel genoma delle piante. In questo metodo, il * Agrobacterium * viene progettato per trasportare il gene desiderato nella sua regione T-DNA, che viene quindi trasferito nella cellula vegetale.
3. Selezione di cellule trasformate: Dopo la trasformazione, le cellule vengono selezionate in base alla presenza del gene marcatore selezionabile. Questo di solito comporta la coltivazione delle cellule sui media contenenti un antibiotico o un erbicida che solo le cellule trasformate possono sopravvivere.
4. Rigenerazione delle piante: Le cellule trasformate vengono quindi coltivate in piante intere.
5. Verifica dell'integrazione del transgene: L'integrazione del gene desiderato nel genoma del cloroplasto è confermata usando tecniche molecolari come PCR o blotting meridionale.
Vantaggi della trasformazione dei cloroplasti:
* Livelli di espressione del transgene elevati: I cloroplasti hanno più copie del loro genoma, portando ad alti livelli di espressione transgene.
* Stabilità del transgene: Il transgene è stabilmente integrato nel genoma del cloroplasto ed è di solito ereditario maternamente.
* Nessuna fuga transgene: Il genoma del cloroplasto non viene trasmesso attraverso il polline, riducendo il rischio di fuga transgene nell'ambiente.
Applicazioni di trasformazione dei cloroplasti:
* Produzione di prodotti farmaceutici: Produzione di proteine terapeutiche, vaccini e altri prodotti farmaceutici.
* tratti delle colture migliorate: Valore nutrizionale migliorato, tolleranza allo stress e resistenza agli erbicidi.
* BioRemidiation: Produzione di enzimi per biorisanamento degli inquinanti.
* Produzione di biocarburanti: Produzione di biocarburanti dalla biomassa.
La trasformazione dei cloroplasti è un potente strumento per introdurre geni nelle piante e ha il potenziale per rivoluzionare l'agricoltura e la biotecnologia.
