* Enzimi di restrizione: Questi enzimi si comportano come forbici molecolari, tagliando il DNA a sequenze specifiche. Sono fondamentali per la creazione di estremità compatibili sul plasmide e sul gene di interesse.
* ligasi: Questo enzima si comporta come colla molecolare, unendo insieme le estremità del plasmide e il gene, formando un plasmide ricombinante.
Analizziamo il processo:
1. Digest di restrizione: Il plasmide e il gene di interesse sono tagliati con lo stesso enzima di restrizione. Questo crea estremità appiccicose compatibili, che sono sporgenze corte a singolo filamento che possono basarsi tra loro.
2. Legation: Il plasmide tagliato e il gene sono miscelati insieme all'enzima ligasi. La ligasi si unisce alle estremità appiccicose, formando un plasmide circolare contenente il nuovo gene.
Altri enzimi importanti:
* DNA polimerasi: Questo enzima può essere usato per colmare le lacune nel DNA, in particolare se il digest di restrizione crea estremità contundenti (senza sporgenze appiccicose).
* fosfatasi alcalina: Questo enzima può essere usato per prevenire l'auto-legatura del plasmide, che può verificarsi se il plasmide viene tagliato con un solo enzima di restrizione.
In sintesi: La combinazione di enzimi di restrizione e ligasi sono i principali attori nell'inserire un nuovo gene in un plasmide. Altri enzimi possono essere utilizzati a seconda dei dettagli specifici del processo di clonazione.
