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Agli albori dell’ingegneria genetica, l’idea di trapiantare tratti da un organismo a un altro sembrava inverosimile. Oggi, tuttavia, l’inserimento di DNA estraneo nel genoma di un ospite è un processo di routine, sia che si tratti di aggiungere geni resistenti ai parassiti nel mais, di esprimere l’insulina umana nei batteri o di modellare tumori umani nei topi. Sebbene i dettagli tecnici possano essere complessi, la sequenza generale dei passaggi rimane coerente e logica.
Iniziare trattando il DNA plasmidico e il frammento di DNA estraneo con un enzima di restrizione scelto. Questi enzimi riconoscono specifici motivi di base ed effettuano tagli precisi, generando estremità compatibili per la legatura a valle. Gli enzimi di restrizione derivano naturalmente dai sistemi di difesa batterica che tagliano il DNA virale invasore.
Successivamente, mescolare la struttura portante del plasmide digerito con il DNA estraneo scisso e aggiungere la DNA ligasi. Le estremità appiccicose complementari risultanti si ricottono e la ligasi sigilla le intaccature, producendo plasmidi circolari che trasportano il segmento di DNA inserito.
Introdurre i plasmidi ricombinanti nelle cellule batteriche competenti e consentire loro di recuperare. Le colonie che hanno assorbito il plasmide cresceranno su terreni selettivi contenenti l'antibiotico appropriato, grazie al marcatore di resistenza codificato sul plasmide. La trasformazione può essere ottenuta tramite shock termico, elettroporazione o competenza chimica, a seconda del ceppo batterico.
Raccogliere cellule da singole colonie, lisarle con un tampone detergente per rilasciare DNA plasmidico, quindi denaturare i filamenti mediante trattamento termico o alcalino. Questo prepara il DNA per lo screening a valle.
Ibridare il DNA estratto con una sonda marcata in modo fluorescente complementare alla sequenza inserita. Esporre il campione all'illuminazione UV; le regioni di corrispondenza perfetta emetteranno fluorescenza, confermando la presenza del gene estraneo.
Selezionare le colonie risultate positive all'inserto, espanderle e isolare il DNA plasmidico. Amplificare il plasmide, se necessario, mediante PCR per generare materiale sufficiente per ulteriori analisi o applicazioni a valle.
