Di Dianne Hermance, aggiornato il 30 agosto 2022
L'elettroforesi su gel è una tecnica fondamentale nella biologia molecolare che separa gli acidi nucleici e le proteine in base alle dimensioni e alla carica. Applicando un campo elettrico attraverso una matrice di gel, le molecole cariche migrano a velocità inversamente proporzionali alla loro lunghezza, consentendo una stima precisa delle dimensioni.
Il mezzo più comune è l'agarosio, un polisaccaride purificato derivato dalle alghe marine. L'agarosio forma una rete porosa che consente a molecole di diverse dimensioni di spostarsi a velocità distinte. Per frammenti inferiori a ~200 bp, un gel di poliacrilammide offre una risoluzione più elevata, sebbene richieda un'attenta manipolazione a causa delle sue proprietà neurotossiche.
Prima di essere versata, la soluzione gel viene miscelata con un colorante intercalante, tradizionalmente bromuro di etidio (EtBr), che emette fluorescenza sotto illuminazione UV quando si lega al DNA. I protocolli moderni utilizzano sempre più alternative più sicure come SYBRSafe o GelRed, anche se a un costo più elevato.
Durante la fusione del gel, un pettine crea pozzetti che vengono successivamente riempiti con il campione miscelato con un colorante di caricamento. Il colorante segue l'avanzamento del campione e aggiunge densità per prevenire la diffusione.
Una volta che il gel si solidifica, viene immerso in un tampone di corsa compatibile. I pozzetti vengono caricati con i campioni di DNA o proteine e una scala di DNA, un insieme di frammenti di dimensioni note, viene posizionata in un pozzetto di riferimento. Una tensione costante (tipicamente 80–120 V) guida le molecole caricate negativamente verso l'elettrodo positivo.
Dopo l'elettroforesi, il gel viene esposto ad un transilluminatore UV. Bande corrispondenti al DNA o all'RNA fluorescenza; le bande proteiche possono essere visualizzate utilizzando Coomassie o colorazione con argento. La distanza di migrazione di ciascuna banda viene confrontata con la scala per dedurre le dimensioni dei frammenti, mentre l'intensità della banda indica la concentrazione relativa.
È essenziale maneggiare con attenzione l'EtBr o le sue alternative, poiché questi composti possono intercalarsi nel DNA e, nel caso dell'EtBr, sono considerati mutageni.
I risultati di alta qualità dipendono da una meticolosa preparazione del gel:utilizzando tamponi appena preparati e privi di RNasi; garantire uno spessore uniforme del gel; ed evitare la contaminazione incrociata tra i campioni. Bande pulite, ben definite e prive di sbavature indicano una separazione riuscita e analisi a valle accurate.
L'elettroforesi su gel è alla base di un'ampia gamma di applicazioni:dall'impronta digitale del DNA nella scienza forense alla valutazione dei prodotti PCR, alla clonazione di frammenti e alla verifica della purezza delle proteine. Un'interpretazione affidabile dei dati elettroforetici è quindi fondamentale sia per la ricerca che per la diagnostica clinica.
