L'analisi del DNA è utile per una serie di applicazioni vitali. Ciò include la diagnosi e il monitoraggio delle malattie, identificazione dei criminali, e studiare la funzione di un segmento mirato di DNA. Però, i metodi utilizzati per le analisi spesso richiedono più DNA di quanto potrebbe essere disponibile in un campione tipico. 'Perciò, l'amplificazione è necessaria, ma non sempre diretto. Il metodo di amplificazione o fotocopia più utilizzato è la reazione a catena della polimerasi (PCR). Un nuovo metodo PCR potrebbe aiutare il processo di amplificazione, e quindi sviluppare saggi robusti che in precedenza non sarebbero stati possibili.

L'acido desossiribonucleico (DNA) è una molecola che si trova nel nucleo delle cellule e porta le 'istruzioni' per lo sviluppo e il funzionamento degli organismi viventi. Viene spesso paragonato a una serie di progetti poiché contiene le istruzioni necessarie per costruire le celle. Queste istruzioni sono divise in segmenti lungo un filamento di DNA.

replica

Il DNA è costituito da una doppia elica di due filamenti complementari costituiti da nucleotidi, una struttura spesso paragonata a una scala. Quando è il momento di replicare, i due filamenti di DNA, o "lati" della scala, si srotolano e si separano. Un enzima chiamato DNA polimerasi legge i singoli filamenti e abbina basi complementari - i "pioli" della scala - al filamento originale. Nuovi filamenti sono prodotti su entrambi i lati del DNA originale, formando due doppie eliche di DNA identiche composte da un filamento originale e uno nuovo. Questo processo si verifica in tutti gli organismi viventi ed è la base dell'eredità biologica.

PCR

La replica può anche essere elaborata artificialmente. A volte chiamato "fotocopia molecolare, "la reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica veloce e relativamente poco costosa utilizzata per amplificare, o fare molte copie di, piccoli segmenti di DNA. Ciò è necessario perché i metodi utilizzati per analizzare il DNA o determinare la sequenza della coppia di basi del DNA richiedono più DNA di quello che potrebbe essere in un campione tipico. Quindi, l'obiettivo con la PCR è amplificare una regione specifica di un filamento di DNA.

Per eseguire la PCR, i due filamenti della doppia elica del DNA sono fisicamente separati applicando una temperatura elevata (93-98 °C) in un processo chiamato fusione del DNA. Nella seconda fase, la temperatura si abbassa e i due filamenti di DNA, ora separato, diventano modelli per i cosiddetti primer. I primer sono brevi molecole di DNA a singolo filamento, complementare alla regione del DNA mirata per l'amplificazione. Dopo aver abbassato la temperatura, i primer aggiunti al processo PCR trovano e si legano al suo bersaglio specifico. Un enzima chiamato DNA polimerasi allungherà - o costruirà - un nuovo filamento di DNA dal primer utilizzando la molecola di DNA a singolo filamento sottostante come modello.

Costruire una scala

Come menzionato sopra, i primer sono brevi molecole di DNA a singolo filamento. Questi sono solitamente lunghi circa 20 nucleotidi. Questa stringa di nucleotidi, si attacca specificamente all'inizio del filamento modello mediante accoppiamento di basi - trovando le basi complementari. La DNA polimerasi è quindi in grado di aggiungere il successivo nucleotide complementare. La polimerasi continua ad aggiungere altri nucleotidi complementari al DNA stampo fino al completamento di un nuovo doppio filamento di DNA, o per usare la metafora sopra; viene costruita una nuova scala, con un lato originale e un lato nuovo.

I doppi primer consentono di definire con precisione l'area di una molecola di DNA da amplificare mediante la PCR. Questi due primer fiancheggianti specificano dove dovrebbe iniziare e finire la nuova catena.

Un piccolo cambio di paradigma

Una regola centrale fortemente ancorata nella mente dello scienziato molecolare è che i primer dovrebbero essere complementari solo alla sequenza bersaglio, e non tra di loro. Questo per evitare che i primer si utilizzino l'un l'altro come modelli e disabilitando così un ulteriore possibile coinvolgimento nell'amplificazione tradizionale del bersaglio.

In un recente studio, pubblicato sulla rivista scientifica PLOS One , Il ricercatore senior Marc Anglès d´Auriac con l'Istituto norvegese per la ricerca sull'acqua (NIVA) mostra che è possibile utilizzare primer altamente complementari e tuttavia evitare le sfortunate conseguenze sopra menzionate. Il nuovo metodo è stato denominato COMPAS-PCR, abbreviazione di COMPlementary Primer Asymmetric PCR.

In breve, Anglès d'Auriac ha osservato che i primer complementari tra loro e un bersaglio (tripla sovrapposizione) potrebbero ancora definire un prodotto di amplificazione quando fanno parte di un motivo o di una struttura di DNA ripetuto. Questo è mostrato nella figura sottostante. Ulteriore, l'ostacolo fisico dell'amplificazione del bersaglio dovuto alla complementarità dei primer è stato alleviato introducendo concentrazioni di primer asimmetriche. Asimmetrico in questo senso significa un numero dispari di molecole tra i due primer. Un primer è costituito da un basso numero di molecole, l'altro con un numero alto.

"Se si utilizzano concentrazioni uguali, come fai di solito per la PCR, i primer, presente in egual misura, si attaccheranno l'uno all'altro, " dice Anglès d'Auriac.

"Con concentrazioni asimmetriche, il primer in eccesso o ad alta concentrazione ha un numero di molecole non bloccato con il primer limitante, e quindi è disponibile per l'amplificazione del bersaglio."

Lavorare da soli

"Questo approccio controintuitivo isolerà, ma anche proteggere, il primer a bassa concentrazione, " dice Anglès d'Auriac.

Con il primer limitante bloccato, e quindi protetto, è possibile che il primer ad alta concentrazione agisca da solo, questo è, fare una copia a filamento singolo del DNA-bersaglio. Quando vengono prodotti sufficienti ampliconi a singolo filamento, possono servire come materiale modello per il primer a bassa concentrazione. Il primer limitante viene rilasciato, e la reazione passa alla classica amplificazione PCR esponenziale.

"Questo amplia le possibilità di applicazione della PCR per lo scienziato, Anglès d'Auriac chiarisce."

Strutture ripetitive

In molti organismi, una frazione significativa del DNA genomico è altamente ripetitiva, con oltre la metà della sequenza costituita da elementi ripetitivi negli esseri umani.

È stata infatti una struttura ripetitiva del DNA che ha indotto Anglès d'Auriac a pensare fuori dagli schemi e a proporre il principio COMPAS-PCR, un piccolo cambiamento di paradigma nel campo della fotocopia molecolare.

Nel processo di esecuzione della diagnosi basata sul DNA per i salmonidi, in particolare l'identificazione della trota fario (Salmo trutta) e del salmone atlantico (Salmo salar) strettamente imparentati, Anglès d'Auriac ha lottato per separare queste specie, compresi gli ibridi tra di loro. Un'identificazione rapida e accurata aiuterebbe a migliorare il monitoraggio e gli studi dell'ecosistema fluviale, poiché l'identificazione degli ibridi è importante per stimare la salute ecologica dei bacini idrografici. Dopo aver utilizzato COMPAS-PCR, Anglès d'Auriac è stato in grado di applicare un metodo di analisi del prodotto PCR chiamato analisi del fuso ad alta risoluzione nell'identificazione della trota fario, Salmone atlantico e loro ibridi in un unico test.

Anglès d'Auriac sottolinea tuttavia che il principio COMPAS-PCR non si limita all'identificazione delle specie ittiche. L'utilizzo di primer quasi completamente complementari mirati alla stessa sequenza può essere applicato a qualsiasi copia adiacente l'una all'altra, in motivi di DNA di interesse come sequenze bersaglio.

"Si dice che le sequenze ripetute del DNA comprendano più del 50% del genoma umano e sono presenti in molte famiglie di geni "domestici" come il gene ribosomiale 5S utilizzato in questo studio. Quindi, i principi generali COMPAS-PCR aiuteranno a sviluppare nuove strategie di amplificazione del DNA sfruttando queste strutture ripetute del DNA, "Conclude Marc Anglès d'Auriac.