I ricercatori dell'Istituto di chimica fisica dell'Accademia polacca delle scienze hanno dimostrato, utilizzando una tecnica microscopica a super risoluzione, come seguire le reazioni chimiche che avvengono in volumi molto piccoli. Il metodo è stato sviluppato in collaborazione con PicoQuant GmbH, e rende possibile osservare reazioni all'interno di singoli organelli cellulari come i nuclei cellulari.

I meccanismi chimici responsabili delle funzioni vitali della cellula nascondono ancora molti segreti:solo di recente i ricercatori hanno avuto gli strumenti per osservare direttamente i fenomeni chimici che si verificano nelle cellule viventi. Però, a causa delle continue limitazioni tecniche, la scienza non ha conoscenze di base sui valori delle costanti di equilibrio delle reazioni chimiche nelle cellule. In altre parole, i ricercatori ancora non sanno quanto di una sostanza chimica coinvolta in una data reazione cellulare sia in una forma già reagita e quanto sia in una forma non reagita. Queste sfide sono state superate nel presente studio. La collaborazione di ricerca ha sviluppato e dimostrato una modifica della spettroscopia di correlazione di fluorescenza a super risoluzione.

"Ci occupiamo di reazioni chimiche nelle cellule da molto tempo. Ad esempio, nel 2013, abbiamo determinato i coefficienti di diffusione di tutte le proteine ​​del batterio Escherichia coli, grazie al quale è stato possibile determinare il tasso di reazioni che si verificano con la loro partecipazione. Qui eravamo interessati a un problema simile in situazioni che coinvolgono basse concentrazioni di reagenti, " afferma il Prof. Robert Holyst (IPC PAS). "Le reazioni biologiche sono generalmente reversibili e, dove si verificano, di solito si crea un certo equilibrio dinamico tra la quantità di sostanze reagite e non reagite. Nei nostri tentativi di determinare le costanti di equilibrio per varie reazioni nelle cellule, abbiamo esaminato la spettroscopia di correlazione di fluorescenza a super risoluzione. E qui, ci siamo imbattuti in un interessante problema tecnico la cui soluzione ci ha aperto nuove possibilità nello studio della chimica della vita."

Esistono molte varietà di microscopia, compresi quelli che visualizzano i singoli atomi. Però, quando si osservano le cellule, la microscopia ottica rimane imbattibile grazie alla sua bassa invasività e alla capacità di visualizzare la struttura spaziale degli organismi viventi. Per molto tempo, il suo svantaggio fondamentale era la sua risoluzione relativamente scarsa:i vincoli fisici fondamentali (diffrazione) rendono impossibile distinguere i dettagli più piccoli di circa 200 nanometri con tecniche ottiche standard.

Un tipo di microscopia ottica è la microscopia a fluorescenza. Implica l'introduzione di un colorante fluorescente nei siti del campione biologico in esame, e quindi scansionare il campione con un raggio laser focalizzato, che stimola le molecole di colorante a brillare. Nel 1994, Stefan W. Hell ha presentato un metodo per superare il limite di diffrazione nella microscopia a fluorescenza mediante riduzione dell'emissione stimolata (STED). STED richiede un raggio laser aggiuntivo simile a una ciambella in sezione trasversale. Tale raggio estingue le aree esterne del fuoco principale del raggio laser e di conseguenza ne riduce le dimensioni a valori inferiori al limite di diffrazione. Con i metodi a super risoluzione è ora possibile vedere dettagli spaziali di soli 10 nm con una risoluzione temporale fino a microsecondi.

La spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) è una nuova branca della microscopia ottica per lo studio del movimento delle molecole. Nelle varietà a super risoluzione, il fuoco del laser ha un volume misurato in decine di attolitri (un attolitro è un miliardesimo di miliardesimo di litro). La misurazione prevede la misurazione della luce emessa da un colorante fluorescente attaccato alla molecola testata eccitata da un raggio laser. Conoscendo la dimensione del fuoco e la durata della fluorescenza, e con l'ausilio di opportuni modelli teorici, è possibile determinare la velocità anche di singole molecole.

"Per un po 'di tempo, è noto che mentre la microscopia FCS a super risoluzione funziona bene quando si osservano molecole che si muovono in due dimensioni, per esempio. nelle membrane lipidiche, fallisce nelle osservazioni in volumi. Tempi di diffusione, determinato sulla base di misurazioni in 3-D, potrebbe differire dalle previsioni delle misurazioni in 2-D di un ordine di grandezza o anche di più. Dopo alcuni mesi di ricerca, ci è apparso chiaro che queste discrepanze erano dovute al modo eccessivamente semplificato di determinare la dimensione spaziale del fuoco, " afferma il dott. Krzysztof Sozanski (IPC PAS).

Sulla base delle proprie analisi teoriche ed esperienze, i ricercatori di Varsavia hanno costruito un nuovo, modello teorico universale introducendo una correzione della forma spaziale del fuoco e tenendo conto del suo impatto sul rapporto segnale-rumore misurato. La correttezza del modello è stata inizialmente verificata nelle misurazioni della velocità di diffusione di varie sonde fluorescenti in soluzioni.

"Abbiamo anche effettuato esperimenti più avanzati. Ad esempio, abbiamo studiato una reazione reversibile in cui le molecole di colorante si attaccavano alle micelle per poi staccarsi dopo qualche tempo. Il sistema, composto da sfere relativamente grandi di molecole di tensioattivo che reagiscono con le molecole di colorante, condizioni riflesse caratteristiche delle strutture biologiche, " dice il dottorando Xuzhu Zhang (IPC PAS). Le misurazioni non erano semplici. Se le molecole di entrambi i reagenti si muovevano lentamente, quando passa attraverso il fuoco il colorante potrebbe fondersi/disconnettersi ripetutamente con/dalle micelle e la luce emessa verrebbe mediata.

Ma potrebbe esserci anche una variante dell'altro estremo:le reazioni di connessione e disconnessione potrebbero essere così lente che durante la transizione attraverso il fuoco non ci sarebbe alcun cambiamento nella relazione tra i reagenti, quindi non ci sarebbe una media. "Il nostro modello prende in considerazione non solo entrambi i casi estremi, ma anche tutti quelli intermedi. E con la conoscenza a nostra disposizione sulla dimensione effettiva del focus, siamo in grado di modificarne le dimensioni ed esaminare sperimentalmente tutti i casi richiesti dal modello sia nello stesso sistema chimico che sulla stessa apparecchiatura, " sottolinea Zhang.

Una caratteristica importante del metodo analitico sviluppato presso l'IPC PAS è il fatto che non sono necessarie modifiche all'apparato per la sua applicazione. Dopo opportuno adattamento, il metodo può essere utilizzato per interpretare in modo più accurato i dati registrati dai microscopi STED predisposti per FCS già in produzione.