L'autoassemblaggio del collagene nelle goccioline in evaporazione genera reti allineate di fibre di collagene. Schema di (A) procedura di colata a goccia e (B) viste dall'alto e laterali di una gocciolina di collagene in evaporazione. Immagini CRM di goccioline di collagene autoassemblate nel bordo (C), (D) vicino al bordo, e (E) regioni intermedie di interesse. Le immagini sono orientate in modo tale che la parte superiore dell'immagine punti verso la linea di contatto della goccia. La posizione di ogni immagine è evidenziata nelle caselle tratteggiate in (B). Le barre della scala rappresentano 50 μm. (F) Frazione di allineamento e diametro della fibra per gel di collagene a goccia. (G) Immagine CRM di una gocciolina di collagene autoassemblata. Cinque immagini CRM separate vengono unite per rivelare l'allineamento radiale delle fibre di collagene. Barra della scala, 100 micron. (H) Frazione di allineamento e diametro della fibra in funzione della distanza dalla linea di contatto per i gel di collagene a goccia. Le soluzioni di collagene (pH 11) sono state gelificate a UR controllata utilizzando una soluzione satura di MgCl2 (UR ~ 31%) su vetro trattato con UVO. *P 0,05 e ***P ≤ 0,001. Credito: Progressi scientifici , doi:10.1126/sciadv.aaz7748
Quando una gocciolina stazionaria contenente un soluto in un solvente volatile evapora, il flusso nella gocciolina può assemblarsi in schemi complessi. I ricercatori hanno esaminato tale trasporto nell'evaporazione di goccioline sessili nei solventi. In un nuovo rapporto ora pubblicato su Progressi scientifici , Bryan A. Nerger e un team di scienziati in ingegneria chimica e biologica, e biologia molecolare presso la Princeton University, NOI., dimostrato flusso in evaporazione di goccioline sessili acquose contenenti il collagene di tipo I polimero autoassemblante. Il materiale può essere utilizzato per progettare reti idratate di fibre di collagene allineate. Il team ha notato l'effetto Marangoni (un termine che deriva dalla diffusione delle goccioline di olio sull'acqua) per dirigere l'assemblaggio delle fibre di collagene attraverso aree su scala millimetrica rispetto all'umidità ambientale e alla forma geometrica della goccia. Nerge et al. cellule muscolari scheletriche incorporate e coltivate nelle goccioline in evaporazione per osservare il loro orientamento collettivo e la successiva differenziazione in miotubi in risposta alle reti allineate di collagene. Il lavoro dimostra un semplice, approccio sintonizzabile e ad alto rendimento per progettare idrogel fibrillari allineati per creare materiali biomimetici carichi di cellule.
La miriade di modelli di deposizione solida che derivano dal flusso di fluido guidato dall'evaporazione è stata segnalata per la prima volta da Robert Brown nel 1828 e successivamente studiata per una varietà di applicazioni odierne, compresa la microfabbricazione e la stampa a getto d'inchiostro. L'anello del caffè o il flusso radiale verso l'esterno può verificarsi anche quando il solvente è volatile, e il flusso di Marangoni sospinto dal calore latente di evaporazione viene soppresso. I flussi di Marangoni derivanti da gradienti termici o guidati da soluti nella tensione superficiale possono anche generare flussi di ricircolo. I ricercatori hanno descritto il flusso nelle goccioline in evaporazione principalmente nel contesto di particelle sospese in solventi che evaporano completamente. In questo lavoro, Nerge et al. ha mostrato come il flusso nelle goccioline in evaporazione potrebbe regolare la velocità di autoassemblaggio delle proteine e controllare l'allineamento delle reti proteiche cariche di cellule fibrose. Il team ha dimostrato che il flusso nelle goccioline acquose in evaporazione di collagene di tipo I neutralizzato genera reti di fibre di collagene allineate.
Gli effetti Marangoni termici e guidati dal soluto hanno permesso il flusso radiale nella gocciolina in evaporazione per orientare le fibre di collagene attraverso l'autoassemblaggio. Gli scienziati hanno messo a punto l'orientamento delle fibre modificando la velocità di autoassemblaggio, umidità ambientale e geometria della goccia. Le cellule muscolari scheletriche incorporate nelle goccioline evaporanti orientate e differenziate in miotubi multinucleati in risposta all'allineamento delle fibre di collagene e solo una frazione dell'acqua evaporata dalla gocciolina, dando origine a un costrutto idrogel carico di cellule. L'idrogel risultante ha ampie applicazioni per progettare scaffold biomimetici per studi di ingegneria tissutale, biologia dello sviluppo e materiali autoassemblanti.
Video CRM time-lapse rappresentativi dei movimenti del tallone nel bordo, vicino, e regioni intermedie di collagene a goccia. L'UR è stata controllata utilizzando una soluzione satura di MgCl2 (RH~31%) e le soluzioni di collagene sono state gelificate su vetro trattato con UVO. Credito: Progressi scientifici , doi:10.1126/sciadv.aaz7748
Autoassemblaggio di fibre di collagene in goccioline di collagene in evaporazione
Il team ha lanciato soluzioni neutralizzate di collagene di tipo I su piatti di coltura con fondo di vetro trattati con ultravioletti (UV)/ozono controllando l'umidità relativa (RH) dei piatti di coltura prima di depositare il collagene all'interno del piatto. Hanno quindi posizionato la capsula di coltura in una capsula di Petri sigillata più grande per avviare l'autoassemblaggio del collagene. I costrutti di collagene si autoassemblano mentre l'acqua evapora dalla gocciolina, e il team ha visualizzato l'orientamento delle fibre di collagene in tre regioni distinte della gocciolina compreso il bordo, vicino al bordo, e il mezzo. Il team ha osservato gli orientamenti delle fibre di collagene all'interno della gocciolina e ha mostrato la loro variazione all'interno delle goccioline in evaporazione.
Nerge et al. perline fluorescenti incorporate nelle goccioline per capire se l'orientamento delle fibre di collagene fosse correlato con i modelli interni di flusso durante l'evaporazione. Hanno quindi osservato il movimento delle perline e l'autoassemblaggio del collagene per suggerire che il flusso di Marangoni guidasse il ricircolo all'interno delle goccioline in evaporazione. I movimenti del tallone erano coerenti con i modelli di allineamento delle fibre di collagene in tutta la gocciolina. Gli scienziati hanno quantificato il flusso calcolando i parametri medi di tempo e di insieme, incluso spostamento quadratico medio (MSD), spostamento totale, e velocità delle traiettorie del tallone. Le misurazioni hanno mostrato una maggiore mobilità per le perline nella regione vicino al bordo della gocciolina, mentre la velocità media delle perline era da cinque a dieci volte superiore nelle regioni marginali o centrali.
L'evaporazione guida modelli regionali distinti di flusso, che vengono attenuati dall'autoassemblaggio del collagene. (A) MSD mediato nel tempo e nell'insieme per le traiettorie del tallone. Le traiettorie nella regione centrale che superano i 300 frame di lunghezza sono state eliminate per migliorare l'efficienza computazionale. La discesa, a, rappresenta l'esponente della legge di potenza che è stato adattato ai dati. (B) Velocità media del tallone radiale per 500 traiettorie del tallone identificate in ciascuna delle tre repliche. (C) Direzione del flusso radiale corrispondente allo spostamento positivo o negativo. Spostamento radiale del cordone nel bordo (D), (E) vicino al bordo, e (F) regioni intermedie di una gocciolina di collagene in evaporazione. Le linee nere rappresentano la riflettanza media a 488 nm. Tempi caratteristici associati alla formazione di fibre di collagene a flusso libero, t1, e la formazione di una rete stabile di fibre di collagene, t2, sono annotate sui grafici (da D a F). a.u., unità arbitrarie. Traiettorie a cordone singolo codificate a colori in base allo spostamento del cordone per il bordo (G), (H) vicino al bordo, e (I) regioni intermedie di una gocciolina di collagene in evaporazione. Vengono tracciate le prime 500 traiettorie che hanno superato i 20 fotogrammi di lunghezza in ciascuna regione di interesse. (J) Campi di flusso osservati in una gocciolina evaporante di collagene contenente perline fluorescenti. Le soluzioni di collagene sono state gelificate a UR controllata utilizzando una soluzione satura di MgCl2 (UR ~ 31%) su vetro trattato con UVO. ***P ≤ 0,001. Credito: Progressi scientifici , doi:10.1126/sciadv.aaz7748
Regolazione dell'allineamento e del diametro della fibra di collagene
Nerge et al. successivamente ha esplorato l'allineamento delle fibre di collagene nelle goccioline dove la velocità del flusso di Marangoni era proporzionale alla velocità di evaporazione. L'allineamento delle fibre di collagene dipendeva dalla velocità di taglio indotta dal flusso. Perciò, il team ha ipotizzato di poter regolare l'allineamento del collagene regolando la variazione di RH (umidità relativa). Il processo ha permesso loro di controllare anche la velocità di evaporazione delle goccioline. Hanno testato questo utilizzando acqua pura e soluzioni saline sature nel piatto di coltura e hanno utilizzato la microscopia a riflessione confocale (CRM) per dimostrare che l'allineamento delle fibre di collagene è diminuito nelle condizioni di alta umidità relativa fornite dall'acqua o dal cloruro di sodio (NaCl). Quando hanno diminuito l'UR utilizzando bromuro di litio (LiBr), la frazione di allineamento è diminuita, mentre aumenta il diametro del collagene a causa della ridotta cinetica dell'autoassemblaggio del collagene. L'UR regolava l'allineamento delle fibre di collagene regolando le portate. Flussi sufficientemente grandi potrebbero quindi interrompere la formazione di una rete stabile di collagene. Il team ha anche variato il pH della soluzione e ha dedotto che l'allineamento delle fibre di collagene fosse una funzione della cinetica dell'autoassemblaggio in una gocciolina in evaporazione. Gli scienziati potrebbero controllare il modello di allineamento del collagene controllando la geometria della gocciolina.
L'UR (umidità relativa) influenza la frazione di allineamento e la geometria delle fibre di collagene. Immagini CRM rappresentative nella regione vicino al bordo di goccioline di collagene autoassemblate in presenza di (A) acqua (RH ~ 100%) e soluzioni sature di (B) NaCl (RH ~ 75%), (C) MgCl2 (UR ~ 31%), o (D) LiBr (UR ~ 6%). Barre della scala, 50 micron. (E) Frazione di allineamento delle fibre di collagene nella regione vicino al bordo delle goccioline di collagene. (F) Velocità media del tallone radiale nella regione vicino al bordo delle goccioline di collagene. La velocità è stata determinata dalla media di 500 traiettorie di sfere. (G) Diametro medio della fibra di collagene nella regione vicino al bordo delle goccioline di collagene. (H) Velocità media del tallone radiale in funzione del tempo nella regione vicino al bordo delle goccioline di collagene. I dati sulla velocità del cordone sono stati livellati utilizzando una media mobile di 10. Le linee nere rappresentano la riflettanza media a 488 nm. Spostamento di microsfere nella regione vicino al bordo delle goccioline incubate con soluzioni sature di (I e J) MgCl2 o (K e L) LiBr. (I) e (K) rappresentano le traiettorie del tallone all'inizio di un esperimento e (J) e (L) rappresentano le traiettorie dopo il tempo caratteristico t2. Il tempo totale durante il quale vengono tracciate le traiettorie è annotato sopra ogni grafico. Le soluzioni di collagene sono state gelificate su vetro trattato con UVO. *P 0,05 e ***P ≤ 0,001. Credito: Progressi scientifici , doi:10.1126/sciadv.aaz7748
Modellazione dell'allineamento delle cellule per la differenziazione
Le reti allineate di fibre di collagene possono tipicamente influenzare il comportamento fisiologico di cellule e tessuti, nonché i processi biologici, come una strada promettente nell'ingegneria dei tessuti. Per determinare se le cellule sono rimaste vitali sul collagene dopo l'evaporazione delle goccioline, Nerge et al. incluso il cancro al seno umano o le cellule muscolari scheletriche nella soluzione di collagene prima della colata e dell'evaporazione. Le cellule del cancro al seno orientate radialmente lungo le fibre di collagene nella gocciolina, e le cellule muscolari scheletriche orientate nella direzione dell'allineamento delle fibre di collagene. Dopo quattro giorni di coltura cellulare, le cellule muscolari scheletriche differenziate per formare miotubi multinucleati allineati alla direzione delle fibre di collagene in tutta la gocciolina. Per confermare l'influenza del collagene sulla differenziazione, gli scienziati hanno coltivato cellule su un substrato di vetro nelle stesse condizioni e hanno notato che le strutture sarcomeriche erano contrastanti più piccole e orientate in modo casuale. I dati hanno dimostrato come l'evaporazione delle goccioline di collagene modellasse l'allineamento e la differenziazione delle cellule su scale di lunghezza millimetrica.
Video CRM time-lapse rappresentativi dell'autoassemblaggio della fibra di collagene nel bordo, vicino al bordo, e regioni intermedie di collagene a goccia. L'UR è stata controllata utilizzando una soluzione satura di MgCl2 (RH~31%) e le soluzioni di collagene sono state gelificate su vetro trattato con UVO. Credito: Progressi scientifici , doi:10.1126/sciadv.aaz7748
In questo modo, Bryan A. Nerger e colleghi hanno utilizzato il flusso Marangoni generato in goccioline evaporanti di collagene di tipo I per regolare l'autoassemblaggio del collagene e produrre reti tridimensionali (3-D) con allineamento di fibre sintonizzabili, diametro e porosità. Hanno impedito l'evaporazione completa delle goccioline per formare reti di fibre di collagene idratate 3D per supportare la crescita e la differenziazione delle cellule di mammifero. Il sistema ha il potenziale per generare un semplice, approccio ad alto rendimento per incorporare espianti di tessuto o organoidi in reti allineate di collagene. L'approccio consentirà la produzione di costrutti tissutali allineati fisiologicamente rilevanti per ampie applicazioni nelle scienze della vita e in medicina.
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