Un western blot consente agli scienziati di rilevare proteine specifiche nei campioni di tessuto. Credito:www.shutterstock.com
La giornalista scientifica Maryanne Demasi è stata scagionata il mese scorso dalle accuse di cattiva condotta della ricerca in relazione al suo dottorato di ricerca all'Università di Adelaide. tesi pubblicata nel 2004.
Le accuse sono state indagate da un gruppo indipendente convocato dall'Ufficio per l'etica della ricerca dell'Università di Adelaide, Conformità e integrità. Comprendeva un ex giudice della Corte Suprema dell'Australia Meridionale e tre professori di scienze mediche non collegati all'Università di Adelaide.
C'erano 17 accuse sulle immagini nella tesi di Demasi. La domanda davanti alla giuria era se le immagini "erano state duplicate e/o manipolate in un modo che si discostava dagli standard applicabili all'epoca".
Tutte le immagini contestate rappresentavano i risultati di esperimenti per rilevare proteine o molecole di RNA. Le tecniche per farlo sono conosciute come "western blot" e "northern blot", rispettivamente.
In 14 casi il panel ha riscontrato che non si era verificata alcuna duplicazione dell'immagine. Nei restanti tre casi Demasi "ha ammesso di aver duplicato o probabilmente duplicato le relative immagini contestate" - ma il panel "non ha potuto ritenere che la duplicazione costituisse una deviazione dagli standard applicabili all'epoca".
Non è chiaro se le immagini macchiate siano al centro di The Journal of Biological Chemistry la sua espressione di preoccupazione nel 2017 in merito a uno dei lavori scientifici di Demasi pubblicato nel 2003.
Demasi nega fermamente qualsiasi cattiva condotta di ricerca sia nella sua tesi che nei documenti di ricerca. Ma cosa sono le macchie occidentali e settentrionali? E perché attirano un tale controllo?
Un buon western blot mostrerà l'intera membrana, da 250 kilodalton a 10 kilodalton, ed essere pulito tranne che per la proteina di interesse. Ogni banda rappresenta un campione diverso, quindi dovrebbe essere visivamente diverso. Credito:macchia occidentale dell'autore
Rilevare le proteine
I western blot rilevano le proteine, e sono una tecnica scientifica comunemente usata e sensibile. L'immagine che producono può sembrare una macchia indefinita, ma i western blot sono in effetti un modo molto utile per individuare una proteina specifica in una complessa miscela di materiali biologici, come sangue o tessuto.
I Western blot sono utilizzati nella diagnosi della malattia di Lyme, Per esempio. Questo perché l'infezione con il batterio che causa Lyme ( Borrelia burgdorferi ) lascia un'impronta digitale unica di proteine nel sangue di un paziente.
I Western blot consentono inoltre ai ricercatori di determinare i cambiamenti nelle proteine in risposta a un regime farmacologico. Nel mio laboratorio, Eseguo regolarmente western blot per misurare i cambiamenti nei profili proteici in risposta a un integratore alimentare che stiamo sperimentando per il trattamento della malattia del motoneurone.
Occidentale, meridionale, settentrionale
I western blot prendono il nome dalla posizione del laboratorio americano in cui sono stati condotti per la prima volta. La scelta del termine "occidentale" è apparentemente in omaggio alle macchie del sud precedentemente nominate (dal nome di Ed Southern) e delle macchie settentrionali, per il rilevamento di DNA e RNA, rispettivamente.
Una miscela di proteine viene prima separata dal loro peso molecolare, con quelli piccoli che si muovono più velocemente e raggiungono prima il fondo del gel, per creare un aspetto simile a una scala. Una macchia proteica ci permette di visualizzare le proteine, dove ogni banda rappresenta una diversa popolazione di proteine. Credito:macchia proteica dell'autore
Per eseguire una macchia occidentale, una miscela di proteine viene caricata su un gel a base di poliacrilammide che permette la separazione delle proteine in base al loro peso molecolare. Il peso molecolare si misura in kilodalton, o kDa (l'unità di massa dalton o atomica è definita come 1/12 del peso dell'isotopo carbonio-12, o circa un atomo di idrogeno).
Quando viene applicata una corrente elettrica, piccole proteine si muovono relativamente rapidamente attraverso il gel, e quelli più grandi più lentamente:il risultato è una distribuzione a scala delle proteine.
Dopodichè, la scala proteica viene immersa in una soluzione anticorpale e incubata. Quando l'anticorpo in eccesso viene lavato via, ti rimane una "banda" in cui il tuo anticorpo si è legato alla tua proteina di interesse.
Cosa cercare
Poiché un western blot è progettato per rilevare una proteina alla volta, l'immagine dovrebbe essere vuota tranne che per la tua fascia di interesse.
Di seguito è riportato un brutto western blot che ho preparato in precedenza. Da adesso, dovresti essere in grado di identificare cosa c'è che non va in questo:ha più bande, il che significa che l'anticorpo non è specifico. E mentre si è tentati di ritagliare bande extra e artefatti estranei, Dovrei davvero tornare al laboratorio per ottimizzarlo.
È importante sottolineare che ogni campione eseguito su un western blot è unico, quindi ogni banda campione dovrebbe anche avere un aspetto diverso.
Un brutto western blot ha più bande invece di una, il che significa che l'anticorpo ha riconosciuto diverse proteine e quindi non è specifico. Non è raro per gli scienziati ritagliare queste immagini per rimuovere gli artefatti offensivi. Di conseguenza, alcune riviste ora richiedono agli autori di inviare l'intero, immagine non ritagliata, per la revisione. Credito:cattivo western dell'autore
Una macchia settentrionale è un concetto simile alla macchia occidentale, ma comunemente usa sonde per rilevare l'RNA invece di quelle per rilevare le proteine. Nella tecnica Southern blot, Viene rilevato il DNA.
Controllo crescente
Dall'avvento di siti web come PubPeer, le macchie occidentali sono sempre più esaminate. Il blog indipendente Retraction Watch cita dozzine di articoli che sarebbero stati ritirati per manipolazione del western blot.
I Western blot possono essere manipolati in diversi modi:duplicando bande proteiche, o capovolgendo verticalmente o orizzontalmente per rendere unici i cinturini riutilizzati. La duplicazione viene in genere eseguita con l'ausilio di software di manipolazione delle immagini, dove è più facile nascondersi.
La manipolazione può essere individuata cercando artefatti come giunzioni evidenti, forme di banda simili, o macchie e graffi che si trasferiscono su cinturini duplicati.
Ma manipolare le immagini non aiuta nessuno. Gli scienziati sono sotto forte pressione per pubblicare o perire, dove le pubblicazioni scientifiche vengono sempre più trattate come valuta da scambiare per promozioni o incarichi.
La manipolazione delle immagini contribuisce solo a diffidare della scienza, in un momento in cui abbiamo sempre più bisogno di difenderla.
Questo articolo è stato originariamente pubblicato su The Conversation. Leggi l'articolo originale. 
