Jeff Chao, Capogruppo Junior presso la FMI, e il suo gruppo ha sviluppato un metodo sofisticato per misurare la degradazione dell'mRNA nelle singole cellule. Hanno sviluppato un biosensore fluorescente che consente di distinguere trascrizioni intatte e intermedi di degradazione. Questo nuovo metodo, noto come TRATTARE, integra bene il metodo che hanno sviluppato in precedenza, chiamato TRUCCO, che misura la traduzione proteica.

La vita di un RNA inizia nel nucleo, dove viene sintetizzato e ulteriormente modificato -capped, splicing e poliadenilato. Quindi si sposta nel citoplasma dove viene tradotto in una proteina, ed eventualmente degradato. La quantità di proteine ​​prodotte dipende in gran parte dalla regolazione della trascrizione, ma anche l'abbondanza di mRNA. In qualità di leader del Gruppo FMI, Jeff Chao sottolinea, "È diventato sempre più chiaro che la regolazione della degradazione dell'mRNA, in particolare durante lo sviluppo o i rapidi cambiamenti ambientali, può influenzare drammaticamente i livelli di RNA." Mentre molti dei passaggi di degradazione dell'RNA sono stati caratterizzati, finora è mancata una chiara comprensione di quando e dove si verifica il degrado.

Jeff Chao e il suo team hanno ora sviluppato un metodo di microscopia a fluorescenza che consente loro di misurare le dinamiche spaziali e temporali della degradazione di singole molecole di mRNA nelle cellule viventi.

Chao e i suoi colleghi hanno approfittato di una struttura di RNA virale che forma una struttura simile a un nodo. Questo pseudo-nodo impedisce la degradazione dell'mRNA da parte di Xrn1, un'esoribonucleasi 5'-3'. Chao spiega:"Con l'aiuto di un biosensore multicolore contenente questi pseudo-nodi virali, siamo stati in grado di distinguere tra trascritti di mRNA intatti e trascritti di mRNA che vengono degradati." Gli scienziati hanno chiamato questa tecnica TREAT for 3(Three)'-RNA End Accumulation durante il fatturato.

Primo e più importante, TREAT ha permesso allo scienziato di osservare la degradazione dell'mRNA in tempo reale nelle cellule viventi. Per visualizzare il degrado, gli scienziati hanno progettato una trascrizione etichettata con due proteine ​​leganti l'RNA fuse a due distinti tag fluorescenti:una delle proteine ​​- PP7 (etichettata con proteina fluorescente verde) - si lega alla regione codificante dell'mRNA, mentre l'altro – MS2 (con un tag rosso) – si lega alla regione 3' non tradotta. Tra PP7 e MS2, gli scienziati hanno introdotto gli pseudo-nodi virali. Così etichettato, i singoli mRNA non tradotti appaiono gialli. Poiché l'RNA viene degradato da XRN1, il PP7 etichettato in verde è spostato. Però, nella posizione dello pseudo-nodo, La degradazione di XRN1 si arresta, che permette di rilevare un viraggio quantificabile del colore dal giallo al rosso.

Inoltre, Chao commenta:"Usando TREAT, siamo stati in grado di misurare il decadimento dell'mRNA in singole cellule e abbiamo scoperto che gli eventi di degradazione individuali si verificano indipendentemente nel citosol. Gli mRNA degradati non si accumulavano nei corpi di elaborazione." Queste sono importanti prime intuizioni perché si pensava che i corpi di elaborazione giocassero un ruolo diretto nella degradazione dell'RNA. I corpi di elaborazione sono compartimenti senza membrana che si formano durante le transizioni di fase. Sono composti da RNA- proteine ​​leganti e mRNA, e poiché contengono molte proteine ​​coinvolte nel turnover dell'mRNA, è stato proposto che siano siti cellulari di degradazione dell'RNA.

"TREAT integra perfettamente l'altra tecnologia che abbiamo sviluppato in precedenza chiamata TRICK. Con la selezione di appropriati marcatori fluorescenti, ora possiamo monitorare sia il turnover dell'RNA che la traduzione dell'RNA "dal vivo", e possiamo affrontare come questi processi sono interconnessi all'interno di una singola cellula, "dice Chao.