Uno studente della Penn State misura la concentrazione di RNA modificata con uno spettrofotometro. I ricercatori hanno scoperto che l'RNA modificato migliora l'efficienza della consegna di CRISPR-Cas9. Credito:Kate Myers/Penn State
Un team di ricercatori interdisciplinari guidato da Penn State ha sviluppato tecniche per migliorare l'efficienza di CRISPR-Cas9, la tecnica di editing del genoma che ha vinto il Premio Nobel nel 2020. Mentre CRISPR-Cas9 è più veloce, meno costoso e più accurato di altri geni di editing metodi, secondo il leader del progetto Xiaojun "Lance" Lian, professore associato di ingegneria biomedica e biologia alla Penn State, la tecnologia ha dei limiti, specialmente nelle applicazioni per migliorare la salute umana.
I ricercatori hanno sviluppato un processo più efficiente e accessibile per applicare i sistemi CRISPR-Cas9 nelle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), derivate da linee di cellule staminali approvate a livello federale, che secondo Lian potrebbero far progredire notevolmente la diagnostica e i trattamenti per le malattie genetiche. L'approccio è stato pubblicato il 7 settembre in Cell Reports Methods .
CRISPR-Cas9, che sta per brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate e proteina 9 associata a CRISPR, offre agli scienziati la possibilità di individuare posizioni precise del codice genetico per modificare il DNA, offrendo opportunità per creare nuovi strumenti diagnostici e mutazioni potenzialmente corrette per trattare le cause genetiche di malattia.
"Il genoma umano è enorme e CRISPR-Cas9 consente agli scienziati di trovare e prendere di mira un gene mutato allo scopo di studiarlo", ha detto Lian.
CRISPR utilizza un disco di materiale genetico, noto come DNA plasmidico, per fornire acido ribonucleico guidato (RNA) che posiziona l'enzima Cas9 nella posizione precisa del gene bersaglio. Quando il DNA viene localizzato, Cas9 si lega ad esso e lo taglia, consentendo ad altro DNA di riparare il taglio. I ricercatori possono quindi vedere come la rimozione cambia l'espressione del gene. Ma secondo Lian ci sono problemi di efficienza nella consegna e nella modifica con gli attuali metodi CRISPR basati sul DNA.
"La consegna degli effettori del DNA CRISPR è bassa", ha detto. "Solo dal 20% al 30% delle cellule bersaglio riceverà DNA di modifica genetica quando si utilizza CRISPR. La consegna di RNA nelle cellule può essere più efficiente; tuttavia, quando viene introdotto l'RNA regolare, le cellule possono vederlo come un virus. Distruggono il L'RNA prima che possa produrre proteine - diciamo, nel giro di poche ore - e, così facendo, distruggere il tentativo di modifica genica".
Per migliorare il risultato, i ricercatori hanno cambiato il modo in cui gli strumenti di modifica del genoma vengono forniti alle cellule staminali, utilizzando l'RNA modificato (modRNA). Il modRNA differisce dal DNA plasmidico in quanto sostituisce uno dei substrati di base presenti nell'RNA con una versione modificata chimicamente ed è stabilizzato da un supporto strutturale più forte.
"Il modRNA è risultato essere notevolmente più efficiente del DNA plasmidico", ha detto Lian. "Circa il 90% delle cellule ha ricevuto il modRNA da una semplice trasfezione, quindi è stato in grado di rimanere al suo posto e fare il suo lavoro."
Il metodo CRISPR a RNA modificato sviluppato dai ricercatori della Penn State offre una maggiore efficienza di modifica dei geni e nessun rischio di inserimento del vettore nel genoma della cellula umana. Credito:Penn State
I ricercatori hanno anche scoperto che la quantità di tempo in cui il modRNA era in posizione era ideale:abbastanza a lungo da modificare le cellule ma non così a lungo da causare attività fuori bersaglio. Ma modRNA ha introdotto un altro problema, secondo Lian.
Quando il modRNA Cas9 viene consegnato con successo al gene bersaglio, crea un'interruzione a doppio filamento nel genoma, che alcune cellule cercheranno di riparare. Quelli che si riparano da soli possono passare la riparazione, o "mutazione", alla loro progenie. Questo è il processo che i ricercatori vogliono capire meglio, quindi queste sono le cellule che vogliono raccogliere e studiare. Il problema, ha detto Lian, è che la maggior parte delle cellule con questa rottura lo identifica come un grave problema con il genoma e si autodistruggerà invece di cercare di ripararsi.
Per ridurre gli effetti collaterali tossici di Cas9 e aiutare le cellule modificate a sopravvivere, il team di Lian ha introdotto una piccola proteina nota per aiutare le cellule a crescere. Secondo Lian, questa proteina aggiunta ha inibito la morte cellulare e migliorato l'efficienza di modifica di Cas9 fino all'84%.
I ricercatori hanno anche scoperto che il modRNA potrebbe migliorare altre tecniche di editing genetico, come l'editing di base. L'editing delle basi può eliminare i geni o correggere le mutazioni nel genoma utilizzando una proteina per modificare un singolo nucleotide invece di tagliare entrambi i filamenti, come fa CRISPR.
"Abbiamo trasfettato le cellule staminali con una proteina di modifica della base a base di plasmidi o a base di modRNA", ha detto Lian. "Il nostro metodo basato su modRNA era più di quattro volte più efficiente, al 68%, rispetto alla tecnica basata su plasmidi, a circa il 16%, nell'editing del genoma con successo."
Secondo Lian, poiché più laboratori di modifica genetica migliorano l'efficienza e l'efficacia della modifica genetica, i ricercatori saranno in grado di comprendere meglio i geni e le loro funzioni più rapidamente.
"Il corpo umano ha più di 20.000 geni, ma studiamo le funzioni solo del 10% circa di essi", ha detto Lian. "Esaminare lo scopo di ogni gene rimanente, uno alla volta, potrebbe richiedere una vita. L'uso di cellule staminali ingegnerizzate dalle nostre tecniche di modifica genetica altamente efficienti può accelerare notevolmente questo processo". + Esplora ulteriormente
