Biomolecole distinte interagiscono specificamente nei processi cellulari e portano a risposte cellulari mirate. Ciò si ottiene spesso dirigendo le biomolecole verso i compartimenti subcellulari. I compartimenti come i mitocondri sono spazialmente separati da membrane. Altri, come i nucleoli, non hanno alcun confine di membrana.

Il modo in cui si formano questi compartimenti senza membrana è ancora uno dei più grandi misteri della biologia. Negli ultimi anni, un fenomeno chiamato separazione di fase liquido-liquido (LLPS) è stato proposto come forza trainante dell'assemblaggio dei compartimenti.

Il gruppo di Andrea Musacchio, direttore presso l'Istituto Max Planck di Fisiologia Molecolare, ha ora sviluppato una strategia di validazione per valutare il ruolo di LLPS nella formazione di compartimenti e per valutare metodi comuni per rilevare le proprietà di LLPS. Lo studio è pubblicato sulla rivista Molecular Cell .

L'applicazione della strategia al processo di assemblaggio del centromero durante la divisione cellulare, che è stato proposto essere guidato da uno scaffold LLPS (il complesso passeggeri cromosomico, o CPC), non è riuscito a identificare LLPS come un fattore cruciale, confermando il basso potere predittivo di questi test . Questa nuova strategia ha il potenziale per diventare uno strumento importante per convalidare il ruolo di altri potenziali fattori trainanti del LLPS identificati finora.

Le proteine, che svolgono la maggior parte delle funzioni del nostro corpo interagendo con altre proteine, si trovano ad affrontare un dilemma:si muovono all'interno della cellula con 40 milioni di potenziali partner di interazione.

Trovare il partner giusto può quindi sembrare come cercare un ago in un pagliaio. Tuttavia, se la probabilità che una proteina incontri per caso il partner giusto al momento giusto può sembrare bassa, la cellula ha trovato una strategia per riunire le proteine ​​che assomiglia all’incontro con un potenziale partner al lavoro, in un bar o in un club:Spatial i segnali guidano le proteine ​​verso compartimenti cellulari definiti, come la membrana plasmatica o il mitocondrio.

Il processo di divisione cellulare, ad esempio, viene avviato da processi di segnalazione sulla membrana cellulare, che attivano enzimi i cui segnali alla fine raggiungono il nucleo cellulare per innescare la trascrizione genetica mirata.

Durante la successiva divisione cellulare, numerose interazioni proteiche specifiche portano alla formazione di un complesso proteico multistrato nei centromeri dei cromosomi, che garantisce una distribuzione priva di errori dei cromosomi in una cellula madre alle sue due figlie.

La natura ha sviluppato una certa chimica per l'interazione delle proteine:le proteine ​​destinate l'una all'altra sono dotate di interfacce evolutive conservate ed esposte con identità chimiche dettagliate che sono complementari tra loro nella loro struttura 3D. Questi motivi si trovano in tutte le specie e consentono interazioni proteiche altamente specifiche.

Un cambio di paradigma?

All'inizio del secolo scorso furono osservati per la prima volta i primi compartimenti cellulari non delimitati da confini fisici. Ora sappiamo che i nucleoli, i corpi P o i granuli di stress concentrano le macromolecole, principalmente proteine ​​e RNA, e hanno importanti funzioni nella cellula.

La scoperta di questi compartimenti senza membrana ha aperto un nuovo campo di ricerca pieno di domande senza risposta, la più impegnativa delle quali riguarda il modo in cui si formano questi compartimenti e il modo in cui mantengono la loro struttura.

Negli ultimi anni, ha acquisito notevole slancio l'idea che questi compartimenti si formino mediante un processo chiamato demiscelazione liquido-liquido o separazione di fase liquido-liquido, paragonabile alla formazione spontanea di goccioline d'olio nell'acqua.

Secondo questo punto di vista, i compartimenti senza membrana sono "condensati" la cui formazione si basa su interazioni transitorie, deboli e non specifiche di proteine ​​"driver", che alla fine ne causano l'accumulo a concentrazioni più elevate rispetto all'ambiente circostante.

I saggi che studiano le proprietà di separazione di fase delle proteine ​​all'esterno della cellula hanno identificato fino ad oggi dozzine di questi fattori, incluso il complesso cromosomico passeggero (CPC), che si ritiene formi condensati nel centromero per modulare la sua organizzazione e funzione durante la mitosi.

In vitro non è in vivo:non puoi trascurare il citosol

"Per molti scienziati la separazione di fase è diventata la spiegazione predefinita per la formazione di compartimenti senza membrana. Tuttavia, ci sono poche prove che i test LLPS eseguiti in vitro possano realmente prevedere un processo fisiologico nell'ambiente della cellula", afferma Musacchio.

Insieme al suo team, ha sviluppato una strategia per valutare un test LLPS ampiamente utilizzato e il suo potere predittivo, applicandolo al CPC.

"A nostro avviso, uno dei principali punti deboli dei test è che non modellano il solvente con sufficiente precisione. Il solvente definisce la solubilità di una proteina e quindi la sua capacità di interagire con altre proteine."

Per imitare il più fedelmente possibile l'ambiente naturale della cellula, gli scienziati hanno aggiunto lisati di cellule batteriche o di mammifero diluite ai tamponi LLPS standard. Anche a concentrazioni altamente diluite, i lisati hanno completamente impedito la formazione di condensati. Per valutare quanto questo fosse generale, gli scienziati hanno ripetuto lo stesso esperimento con diverse proteine ​​aggiuntive, che hanno tutte mostrato proprietà LLPS nel test standard. E infatti, in tutti i casi l'aggiunta di lisati cellulari ha sciolto i "condensati".

"Questi risultati confermano la nostra ipotesi che l'ambiente cellulare tampona efficacemente le interazioni deboli non specifiche che si ritiene causino LLPS in vitro", afferma Musacchio.

Scarso potere predittivo

Le interazioni e le funzioni delle proteine ​​nella cellula sono fortemente regolate dalle cosiddette modificazioni post-traduzionali. L'aggiunta o la rimozione mirata di gruppi fosfato in punti critici, ad esempio, può interrompere l'interazione tra due proteine ​​con effetto immediato. Queste modifiche naturali possono essere imitate in laboratorio mediante mutazioni e rappresentano il metodo di scelta quando si tratta di studiare molti processi cellulari.

Introducendo mutazioni in quattro residui coinvolti nel riconoscimento dei segnali fosforilati, lo scienziato ha generato un mutante del CPC che non può essere reclutato nei centromeri e non vi si accumula. Tuttavia, questo mutante ha ancora mostrato il pieno potenziale LLPS nel test in vitro, dimostrando che il test non è in grado di prevedere la localizzazione e la funzione del CPC.

"I nostri risultati mostrano che l'LLPS di un singolo componente in vitro non può prevedere la solubilità e la localizzazione nell'ambiente complesso e affollato della cellula. L'elenco dei presunti scaffold LLPS identificati attraverso i test stabiliti richiederà un ampio riesame e la strategia di validazione che noi che presentiamo qui possono guidare questo sforzo," dice Musacchio.

"In futuro, prevediamo di ripetere i nostri esperimenti con molti presunti scaffold LLPS, in particolare quelli che sono diventati fiori all'occhiello nella crescita del campo LLPS. I nostri esperimenti mostrano che il citosol è un potente solvente il cui ruolo non può essere trascurato. Pertanto, sarà importante generare terreni citomimetici appropriati come standard per valutare le reazioni biochimiche in vitro. Cercheremo di contribuire a quest'area di ricerca."