Le moderne tecniche di microscopia consentono di esaminare il funzionamento interno delle cellule con dettagli sorprendenti. "Ora possiamo osservare la disposizione e l'interazione delle singole proteine ​​al microscopio", afferma il professor Ralf Jungmann, titolare della cattedra di Fisica Molecolare della Vita presso la LMU e Max Planck Fellow presso l'MPI di Biochimica.

Il team del biofisico ha recentemente sviluppato il rivoluzionario metodo RESI (Resolution Enhancement by Sequential Imaging). Questa tecnica può essere utilizzata per migliorare la risoluzione della microscopia a fluorescenza fino alla scala di Ångström, molto al di sotto del classico limite di diffrazione della luce. A questo scopo sono cruciali le molecole marcatori coniugate al DNA, che i ricercatori collegano esattamente alle molecole che vogliono comprendere meglio.

Il team di Jungmann ha ora presentato una tecnica nella rivista Nature Methods che può essere utilizzato per quantificare quanto bene le molecole dei biomarcatori si legano alle proteine ​​​​bersaglio. "Questo è assolutamente fondamentale se si vogliono fare affermazioni quantitativamente affidabili", spiega il fisico.

Se si conosce l'efficienza dell'etichettatura, è possibile eseguire in questo modo la proteomica risolta spazialmente. In questo modo è possibile scoprire non solo cosa fanno le singole proteine ​​in una cellula, ma anche in che misura sono presenti e come cambiano la loro quantità e il loro comportamento in determinate circostanze. "Ma questo è possibile solo se possiamo valutare quanto bene ha funzionato l'etichettatura." Questo perché solo le proteine ​​marcate emettono lampi di luce al microscopio e diventano così visibili.

Il metodo sviluppato dal team di Jungmann rende possibile questa valutazione aggiungendo un biomarcatore di riferimento alle proteine ​​bersaglio. Questo marcatore "si illumina" di un colore diverso durante la microscopia, in modo che le proteine ​​contrassegnate con successo appaiano in due colori.

Il team di Jungmann lo ha dimostrato utilizzando, tra l'altro, la proteina di membrana CD86:il riferimento produce una fluorescenza rosa, il marcatore vero e proprio una fluorescenza bluastra. Questo crea uno schema di innumerevoli punti di luce rosa e blu. Dove la marcatura non ha funzionato si illumina singolarmente solo il riferimento. L'efficienza della marcatura è calcolata dal rapporto tra molecole illuminate doppie e singole.

Il metodo offre numerosi vantaggi rispetto ai metodi precedenti per determinare l'efficienza di legame. "Funziona non solo in vitro, ma anche in vivo, cioè nel contesto di cellule intatte", spiega Jungmann. "La tecnica può anche essere applicata a una varietà di molecole bersaglio, biomarcatori e campioni diversi ed è compatibile con tutta una serie di metodi a super-risoluzione."

Uno strumento affidabile e ampiamente applicabile per valutare l'efficienza dei marcatori è fondamentale per garantire una valutazione accurata dei dati e consentire confronti affidabili tra diversi leganti, condizioni di etichettatura e laboratori di ricerca.

Gli autori dello studio sono certi che il nuovo metodo di quantificazione abbia aperto la strada per espandere significativamente il potenziale del loro metodo al microscopio a super risoluzione:"Ora possiamo considerare anche specifiche applicazioni biomediche in cui la rilevazione quantitativa di proteine ​​e processi è di grande importanza importanza", afferma Jungmann.

Ciò include, ad esempio, la ricerca sul cancro, dove le informazioni sulle interazioni tra le proteine ​​sulla superficie cellulare e i farmaci con risoluzione molecolare sono essenziali per lo sviluppo di nuovi tipi di farmaci.