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    Spettacolo di luci nelle cellule viventi:un nuovo metodo consente la marcatura fluorescente simultanea di molte proteine
    Immagini al microscopio a fluorescenza dei pool vpCell. Credito:Andreas Reicher

    L'osservazione precisa delle proteine ​​all'interno delle cellule è estremamente importante per molti rami della ricerca, ma ha rappresentato una sfida tecnica significativa, soprattutto nelle cellule viventi, poiché la necessaria marcatura fluorescente doveva essere attaccata individualmente a ciascuna proteina.



    Il gruppo di ricerca guidato da Stefan Kubicek al CeMM ha ora superato questo ostacolo:con un metodo chiamato "vpCells" è possibile etichettare molte proteine ​​contemporaneamente, utilizzando cinque diversi colori fluorescenti. Questo approccio automatizzato ad alto rendimento, aiutato dal riconoscimento delle immagini assistito dall’intelligenza artificiale, apre applicazioni completamente nuove in varie discipline, dalla biologia cellulare fondamentale alla scoperta di farmaci. Lo studio è stato pubblicato sulla rivista Nature Cell Biology .

    Senza proteine, la vita come la conosciamo sarebbe inconcepibile. Forniscono la struttura strutturale per le cellule, agiscono come enzimi per controllare il metabolismo e consentono alle cellule di comunicare con l'ambiente come recettori di membrana, trasportatori o molecole di segnalazione. Tutte queste funzioni possono essere soddisfatte solo se le proteine ​​si trovano nel posto giusto all'interno della cellula. Spesso, anche le proprietà di una proteina cambiano quando cambia la sua posizione:il controllo sulla sua localizzazione nella cellula significa quindi anche il controllo sulla sua funzione.

    Per comprendere ed esplorare la funzione delle proteine, è essenziale determinare e tracciare con precisione la loro posizione all'interno della cellula. Le proteine ​​spesso si spostano dinamicamente tra diversi organelli e compartimenti della cellula. Per visualizzarli al microscopio, spesso sono collegati a una componente proteica fluorescente e brillante. Tuttavia, questo metodo ha dovuto affrontare difficoltà tecniche:in genere, il componente fluorescente poteva essere attaccato solo a una proteina alla volta e, per etichettare più proteine, le cellule solitamente dovevano essere uccise e fissate.

    Crescita di un pool vpCell. Credito:(c) Andreas Reicher/Jiri Reinis

    Il nuovo metodo presentato dal gruppo di Stefan Kubicek, chiamato "visual proteomics Cells" (abbreviato vpCells), consente di marcare le proteine ​​in modo fluorescente in modo da preservarne i meccanismi di regolazione endogeni. Invece di etichettare una proteina alla volta, le vpCells possono fondere molte proteine ​​simultaneamente con un tag fluorescente in un cosiddetto approccio multiplex.

    Un precursore di questo metodo era già stato descritto dal team di Kubicek nel 2020 per lo studio degli enzimi metabolici. Ora è stato ampliato e migliorato in tre modi:

    In primo luogo, vpCells può etichettare tutte le proteine ​​teoricamente possibili utilizzando lo strumento di modifica genetica CRISPR/Cas9 per attaccare geneticamente le proteine ​​fluorescenti alle proteine ​​in esame. Il gruppo di Kubicek ha creato una "biblioteca" dell'intero genoma a questo scopo, consentendo la marcatura fluorescente e l'esplorazione funzionale sistematica di tutte le possibili proteine ​​umane.

    In secondo luogo, vpCells utilizza non solo un colore fluorescente ma un totale di cinque colori complementari. In ciascuna cella vengono contrassegnate due diverse proteine ​​da tracciare. Inoltre, viene utilizzata un'altra marcatura colorata per distinguere meglio i singoli cloni. E altri due colori contrassegnano il nucleo cellulare e la membrana per delineare meglio le singole cellule.

    In terzo luogo, questo schema di colori consente non solo di generare immagini visivamente accattivanti, ma anche di riconoscere e discriminare otticamente le diverse proteine. Normalmente, ciò richiede un complesso sequenziamento del DNA dopo l'imaging per determinare quale proteina è etichettata. L'approccio vpCells, d'altro canto, consente di addestrare un sistema di riconoscimento delle immagini assistito dall'intelligenza artificiale a riconoscere quale proteina è marcata in quale cellula basandosi esclusivamente su immagini al microscopio a fluorescenza.

    Immagini al microscopio a fluorescenza dei pool vpCell. Credito:Andreas Reicher

    Il metodo ha già dimostrato la sua utilità in due applicazioni:da un lato sono state generate più di 4.500 linee cellulari come reporter per oltre 1.100 proteine. Queste linee cellulari sono state utilizzate per addestrare i modelli AI e per descrivere la localizzazione delle proteine ​​nel loro stato basale. Tutte le immagini delle singole proteine ​​etichettate sono disponibili sul database web accessibile al pubblico vpCells.

    D'altra parte, le cellule reporter viventi sono state utilizzate per una domanda di ricerca specifica:il team di Kubicek ha esaminato l'effetto di oltre 1000 sostanze a piccole molecole su 61 proteine ​​rilevanti per le cellule tumorali. I ricercatori hanno scoperto che 44 delle sostanze testate alteravano la quantità o la localizzazione delle singole proteine ​​entro 6 ore. Una delle sostanze si è rivelata un inibitore del trasporto delle proteine ​​dal nucleo cellulare, che ha un effetto simile a un farmaco clinicamente approvato per il mieloma multiplo, un cancro del sistema di formazione del sangue.

    "Questi risultati forniscono un primo sguardo alla versatilità del metodo vpCells", afferma Kubicek. "Ci aspettiamo molte altre applicazioni future, dalla biologia cellulare fondamentale alla scoperta applicata di farmaci."

    Ulteriori informazioni: Etichettatura multicolore in pool per la visualizzazione della dinamica delle proteine ​​subcellulari, Nature Cell Biology (2024). DOI:10.1038/s41556-024-01407-w

    Informazioni sul giornale: Biologia cellulare naturale

    Fornito dal Centro di ricerca CeMM per la medicina molecolare dell'Accademia austriaca delle scienze




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