1. Isolare il gene dell'insulina umana
* estrazione mRNA: L'mRNA di insulina umana viene estratto da cellule che producono insulina (cellule beta nel pancreas).
* Trascrizione inversa: L'mRNA viene convertito in DNA complementare (cDNA) usando la trascrittasi inversa. Questo cDNA è una copia stabile del gene dell'insulina.
2. Modifica del gene (opzionale)
* Ottimizzazione per l'espressione batterica: Il gene dell'insulina potrebbe aver bisogno di lievi modifiche per garantire che sia espresso in modo ottimale dai batteri. Questo potrebbe comportare:
* Modifica dei codoni: Il codice genetico può essere leggermente modificato per abbinare i codoni preferiti utilizzati dai batteri.
* Aggiunta di siti di enzimi di restrizione: Ciò consente un inserimento preciso nel plasmide.
3. Preparazione del plasmide
* Scegliere il plasmide: Viene selezionato un vettore di plasmide adatto. Queste sono piccole molecole di DNA circolare che possono replicare indipendentemente all'interno dei batteri. In genere hanno:
* Origine della replica: Questa sequenza consente al plasmide di replicare all'interno della cellula batterica.
* Gene di resistenza agli antibiotici: Questo gene consente la selezione di batteri che trasportano il plasmide.
* Sito di clonazione multipla (MCS): Questa regione contiene una varietà di siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione, consentendo un facile inserimento del gene dell'insulina.
4. Tagliare il plasmide e inserire il gene
* Enzimi di restrizione: Il plasmide e il gene dell'insulina vengono tagliati usando enzimi di restrizione, che riconoscono sequenze di DNA specifiche. Questo crea "estremità appiccicose" corrispondenti su entrambe le molecole di DNA.
* Legation: Il plasmide tagliato e il gene dell'insulina modificato vengono miscelati insieme alla ligasi del DNA. Questo enzima si unisce alle estremità appiccicose, inserendo efficacemente il gene dell'insulina nel plasmide.
5. Transforming batteri
* Celle competenti: I batteri sono resi "competenti" per assumere il DNA. Ciò potrebbe comportare il trattamento con cloruro di calcio o altri metodi.
* Trasformazione: Il plasmide contenente il gene dell'insulina viene introdotto nelle cellule batteriche competenti.
* Selezione: I batteri che hanno raccolto con successo il plasmide vengono selezionati placcandoli su un mezzo di crescita contenente l'antibiotico a cui il plasmide conferisce resistenza. Solo quei batteri che hanno il plasmide possono sopravvivere.
6. Espressione di insulina
* Produzione: I batteri trasformati ora trasportano il gene dell'insulina umana ed lo esprimono, producendo proteina di insulina umana.
* Purificazione: La proteina dell'insulina viene estratta e purificata dalle cellule batteriche.
In sintesi:
Questo processo consente la produzione su larga scala di insulina umana, un trattamento vitale per il diabete. Combinando il potere dell'ingegneria genetica, dei sistemi di espressione batterica e dei rigorosi metodi di purificazione, gli scienziati possono produrre insulina sicura ed efficace per milioni di persone in tutto il mondo.
