Metodi per isolare gli aminoacidi liberi dalle proteine
1. Idrolisi:
* Idrolisi acida: Il metodo più comune. Acidi forti (come HCL) sono usati per rompere i legami peptidici nella proteina, rilasciando i singoli aminoacidi.
* Procedura:
* Il campione di proteine viene trattato con HCl concentrato (in genere 6 m) ad alte temperature (100-110 ° C) per 12-24 ore.
* Questo processo divide tutti i legami peptidici, liberando gli aminoacidi liberi.
* Dopo l'idrolisi, l'acido viene rimosso per evaporazione, lasciando la miscela di aminoacidi.
* Vantaggi: Efficace, relativamente semplice.
* Svantaggi: Può portare al degrado degli aminoacidi, in particolare triptofano. Alcuni aminoacidi come la cisteina possono essere distrutti o modificati.
* Idrolisi enzimatica: Utilizza enzimi specifici (come proteasi) per abbattere le proteine in peptidi e, in definitiva, aminoacidi liberi.
* Procedura:
* Gli enzimi specifici sono selezionati in base alla struttura della proteina e al risultato desiderato.
* L'incubazione con l'enzima in condizioni ottimali consente la rottura controllata.
* Vantaggi: Le condizioni più lievi, meno degradazione, possono essere più selettive.
* Svantaggi: Può essere più costoso, più lento dell'idrolisi acida.
2. Separazione e purificazione:
* Cromatografia:
* Cromatografia a scambio ionico: Separa gli aminoacidi in base alla loro carica.
* Cromatografia ad esclusione dimensionale: Separa gli aminoacidi in base alle loro dimensioni.
* Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC): Metodo altamente sensibile e preciso per separare e quantificare gli aminoacidi.
* Elettroforesi: Separa gli aminoacidi in base alla loro carica e dimensione.
Considerazioni:
* Fonte proteica: Il tipo di proteina con cui inizi influenzerà il metodo migliore.
* Risultato desiderato: Stai semplicemente cercando di identificare la presenza di aminoacidi liberi o devi quantificarli?
* Sensibilità: Il livello di sensibilità richiesto nell'analisi.
* Costo e attrezzatura: Considera le risorse disponibili.
Flusso di lavoro generale:
1. Preparazione delle proteine: Isolare e purificare la proteina di interesse.
2. Idrolisi: Scegli il metodo di idrolisi appropriato (acido o enzimatico).
3. Separazione e purificazione: Seleziona e ottimizza il metodo per separare e isolare gli aminoacidi liberi.
4. Identificazione e quantificazione: Usa tecniche come cromatografia, elettroforesi o altri metodi analitici per identificare e quantificare gli aminoacidi liberi.
Nota importante: Le procedure e le condizioni specifiche per l'isolamento di aminoacidi liberi dalle proteine varieranno a seconda della fonte proteica, del risultato desiderato e delle risorse disponibili.
