Di Palmer Owyoung
Aggiornato il 30 agosto 2022

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Il codice genetico di una cellula risiede nel suo DNA, che rimane bloccato nel nucleo. Per studiare l'espressione genica o per generare librerie di DNA complementari (cDNA), il DNA deve prima essere trascritto in RNA messaggero (mRNA). L'isolamento di mRNA di alta qualità è essenziale per rilevare trascrizioni rare, progettare sonde per microarray e costruire librerie di cDNA.

Isolamento dell'mRNA dall'RNA totale

Passaggio 1 – Omogeneizzazione del TRIzol

Iniziare risospendendo le cellule pellettate nel reagente TRIzol (Life Technologies) o in una soluzione equivalente di fenolo-guanidina come il reagente TRI di Ambion. Questo reagente lisa le cellule, denatura le proteine e protegge contemporaneamente l'RNA dalla degradazione enzimatica.

Passaggio 2 – Isolamento totale dell'RNA

Eseguire una serie di centrifugazioni per separare i componenti cellulari in fasi distinte. Eliminare lo strato superiore giallo e ricco di grasso. Raccogliere la fase acquosa rossa, che contiene la popolazione completa di RNA (mRNA, tRNA, rRNA e RNA non codificanti). Seguire il protocollo di estrazione con fenolo-cloroformio, quindi lavare il pellet di RNA con isopropanolo ed etanolo. Aggiungi inibitori della RNasi per preservare l'integrità dell'RNA.

Passaggio 3 – Estrazione dell'mRNA

I kit commerciali forniscono la purificazione dell'mRNA più riproducibile. Le scelte più popolari includono FastTrack 2.0 di Invitrogen e il kit di isolamento mRNA Poly(A)Pure di Ambion. Un tipico protocollo del kit procede come segue:

• Combina fino a 300 µl di RNA totale con il tampone di lisi inibito da RNasi del kit.
• Riscaldare a 65°C per 5 minuti, quindi raffreddare subito sul ghiaccio.
• Aggiungere 0,5 M NaCl e sciogliere l'oligo‑dT (acido oligodeossitimidilico) fornito nella miscela.
• Centrifugare e recuperare il surnatante; legare l'mRNA alla matrice di silice fornita.
• Lavare ripetutamente con tampone legante a basso contenuto di sale e poi con tampone di lavaggio.
• Eluire l'mRNA nel volume specificato (tipicamente ~500μL).
• Precipitare l'eluato con acetato di sodio ed etanolo, quindi risospendere in 10–20 µl di acqua trattata con DEPC.
• Conservare a –80°C e valutare la concentrazione e la purezza utilizzando uno spettrofotometro UV.

Cose necessarie

• Cappa a flusso laminare
• Dispositivi di protezione individuale (camice da laboratorio, guanti, protezione per gli occhi)
• Pipette, puntali, contenitori per lo smaltimento di materiali a rischio biologico
• Centrifuga ad alta velocità, blocco termico
• Superfici da banco prive di RNA
• Reagenti RNAzap o RNAoff
• Kit commerciali per l'estrazione dell'mRNA (Invitrogen, Ambion, ecc.)
• Acetato di sodio, etanolo, isopropanolo
• Acqua trattata con DEPC
• Spettrofotometro UV e materiali di consumo
• Celle adatte per l'estrazione dell'RNA
• TRIzol o reagente TRI
• Inibitori della RNasi

TL;DR

Mantenere freddi tutti i reagenti, le cellule e l'RNA estratto posizionandoli sul ghiaccio. Le condizioni fredde inibiscono l'attività della RNasi rilasciata durante l'omogeneizzazione.

Avviso

Il TRIzol e reagenti simili contenenti fenolo-guanidina sono tossici. Evitare il contatto con la pelle e le mucose e attenersi rigorosamente ai protocolli di sicurezza istituzionali.

Riferimenti

• "Protocolli della libreria cDNA"; Ian G. Cowell e Caroline A. Austin, 1997
• "Protocolli di trascrizione e traduzione in vitro"; Martin J. Tymms, 1995