Di Sarah Quinlan
Aggiornato il 30 agosto 2022
Secondo BioWeb dell’Università del Wisconsin, un primer per PCR è un oligonucleotide corto e sintetico, in genere lungo da 18 a 25 nucleotidi, utilizzato per amplificare specifici segmenti di DNA tramite reazione a catena della polimerasi (PCR). Sia i primer diretti che quelli inversi, progettati come complementi inversi, fiancheggiano la regione target per facilitare l'amplificazione. Quando i ricercatori prendono di mira un gene o una regione specifica del DNA, la PCR genera materiale sufficiente per le analisi a valle. Se non sono disponibili primer adatti dalla letteratura pubblicata o da fonti commerciali, la progettazione di primer personalizzati diventa essenziale.
Inizia recuperando la sequenza nucleotidica del tuo gene bersaglio o della regione del DNA e decidi la lunghezza del frammento che desideri amplificare. La PCR convenzionale amplifica i frammenti compresi tra 100 e 1.000 paia di basi, mentre la PCR in tempo reale in genere prende di mira da 50 a 200 paia di basi.
Determina dove all'interno della sequenza si legheranno i tuoi primer:vicino all'estremità 5′ o 3′, al centro o su un introne, se lo desideri.
Aderire alle linee guida stabilite per la progettazione dei primer; il successo dell'amplificazione dipende dalla qualità del primer e dai parametri chiave.
Primer di progettazione lunghi 18-24 nucleotidi. Il Dr. Vincent R. Prezioso, Ph.D., di Brinkmann Instruments consiglia questa gamma per una specificità ottimale e una ricottura efficiente. Obiettivo una temperatura di fusione (Tm) di 55–80°C, un contenuto GC del 40–60% e un morsetto GC all'estremità 3′. Evitare tre o più basi G/C nelle ultime cinque posizioni per ridurre il legame non specifico.
Evitare sequenze di quattro o più nucleotidi identici o ripetizioni dinucleotidiche, poiché ciò può portare a un priming errato. Garantire che non vi sia alcuna complementarità intra-primer o inter-primer che potrebbe formare autodimeri o dimeri di primer.
Utilizza strumenti online affidabili:Primer3 del MIT , Primer‑Blast di NCBI e OligoAnalyzer di IDT —per valutare le proprietà dei primer e prevedere le strutture secondarie.
