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Le membrane cellulari sono composte da doppi strati fosfolipidici con proteine incorporate che mediano le funzioni cellulari essenziali. La microscopia ottica tradizionale non è in grado di risolvere le singole proteine di membrana. La frattura da congelamento, combinata con la microscopia elettronica, ci consente di dividere le membrane congelate lungo il loro doppio strato, esponendo la distribuzione delle proteine all'interno della matrice lipidica. Integrando ulteriori tecniche di etichettatura, i ricercatori possono mappare proteine specifiche, nonché componenti batterici e virali, con precisione sub-nanometrica.
1. Congelare rapidamente cellule o tessuti in azoto liquido per immobilizzare le strutture.
2. Utilizzare un microtomo per fratturare il campione congelato; la membrana si divide tra i due lembi fosfolipidici dove le interazioni idrofobiche sono più deboli.
3. Eseguire l'incisione a freddo sotto vuoto spinto per rimuovere i cristalli di ghiaccio, preservando i dettagli più fini.
4. Ombreggiare la superficie della frattura con una sottile pellicola di carbonio e platino per creare una replica stabile che segua la topologia della membrana.
5. Digerire il materiale organico residuo con acido, lasciando un guscio di platino che rappresenta la superficie esposta della membrana.
6. Esaminare la replica mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per l'analisi strutturale.
L'incisione a freddo rimuove i cristalli di ghiaccio che altrimenti oscurerebbero i dettagli della membrana. Il processo di essiccazione sotto vuoto preserva l'architettura nativa e consente l'osservazione delle attività dinamiche della membrana, degli organelli intracellulari e degli assemblaggi virali.
La microscopia elettronica a trasmissione offre un ingrandimento fino a 1 milione di volte e risoluzioni fino a 3 nm, rendendola la modalità preferita per le repliche di fratture da congelamento. La microscopia elettronica a scansione (SEM) è usata meno comunemente in questo contesto, ma può fornire la topologia superficiale di campioni più grandi.
Sin dalla sua introduzione oltre cinquant’anni fa, la TEM da congelamento-frattura è stata determinante nel confermare il modello del doppio strato lipidico della membrana plasmatica e nel chiarire la disposizione spaziale delle proteine integrali, periferiche e ancorate ai lipidi. La tecnica rivela se le proteine sono "galleggiante" che vanno alla deriva all'interno del doppio strato o "ancore" che si estendono su entrambi i lembi, ed è in grado di rilevare l'aggregazione o il raggruppamento delle proteine. Se abbinati alla marcatura immunogold (anticorpi marcati con particelle dense di elettroni), i ricercatori possono identificare proteine specifiche e dedurre i loro ruoli funzionali.
