Le proteine ​​sono i cavalli di battaglia della cellula. La loro attività è spesso controllata aggiungendo o rimuovendo sostanze chimiche chiamate fosfati, come accendere o spegnere una corrente elettrica. Misurare quante proteine ​​sono fosforilate, o acceso, è stato un ostacolo per la ricerca. Poiché le proteine ​​fosforilate sono difficili da ottenere in grandi quantità, possono essere difficili da analizzare, anche utilizzando strumenti avanzati come uno spettrometro di massa.

I ricercatori del Pacific Northwest National Laboratory hanno escogitato un modo per misurare e distinguere piccole quantità di proteine ​​fosforilate, un approccio che potrebbe essere utilizzato nella ricerca per aiutare a curare malattie come il diabete e il cancro. Lo studio appare come l'articolo di copertina della rivista del 7 maggio Chimica analitica .

Distinguere le proteine ​​fosforilate

In uno spettrometro di massa, le molecole si raccolgono in una trappola appena davanti al dispositivo di misurazione, come veicoli in attesa su una rampa di un'autostrada con tassametro, ha affermato la coautrice Karin D. Rodland, borsista di laboratorio del PNNL e ricercatore biomedico. La trappola viene rilasciata una volta accumulato un numero sufficiente di molecole. Ciò consente alle molecole di avanzare come i veicoli quando la luce sulla rampa diventa verde.

Ma quando in un campione sono presenti bassi livelli di proteine ​​fosforilate, il loro segnale è spesso troppo debole per essere rilevato da uno spettrometro di massa, quindi le molecole si bloccano ancor prima di essere misurate.

In questo studio, i ricercatori hanno cercato di amplificare i segnali per aggirare la barriera e rendere misurabili anche i bassi livelli di proteine. Per poterlo fare, il team ha implementato una tecnica esistente chiamata etichettatura isobarica, che etichetta chimicamente i campioni. Ogni tag è unico e si attacca e identifica tutte le proteine ​​all'interno di un dato campione. Più importante, una volta che i campioni etichettati singolarmente sono stati mescolati, diventano un unico, campione chimicamente identico.

"Agli occhi dello spettrometro di massa, " ha detto l'autore corrispondente Tao Liu, uno scienziato biomedico al PNNL, "il campione si presenta come un'unica identità."

Abilmente, i ricercatori hanno etichettato isobaricamente e mescolato un materiale "potenziante" con i campioni dello studio che erano in quantità limitata, con un rapporto di potenziamento/campione di 30 a 1. Questo materiale di potenziamento è biologicamente simile ai campioni di studio in modo che i cataloghi proteici siano simili ed è prontamente disponibile in una quantità molto maggiore. Per esempio, linee cellulari miste possono essere utilizzate per imitare i tessuti.

La combinazione del materiale di amplificazione e dei campioni di studio ha reso il segnale complessivo abbastanza grande da essere rilevato dallo spettrometro di massa. Questo essenzialmente ha ingannato lo strumento, che non è in grado di effettuare alcuna misurazione quando il campione è troppo piccolo, a dare il via libera all'intero campione per l'analisi.

La tecnologia è molto simile a come le auto e i camion si smistano in base alla velocità una volta che si immergono nell'autostrada, e poi distinguendo le auto dai loro colori, disse Rodland. Quei veicoli non sarebbero mai stati smistati se non avessero ricevuto il segnale di "via" dal dispositivo di misurazione.

Poiché lo spettrometro di massa ha scomposto il campione etichettato isobaricamente e miscelato per l'analisi, i rapporti in cui sono apparsi i tag hanno permesso agli scienziati di determinare la quantità di ciascun peptide presente in ciascun campione originale.

Passi avanti nella rilevazione delle malattie

Utilizzando la strategia di etichettatura/amplificazione isobarica, il team ha prima dimostrato che tre diverse linee cellulari di leucemia mieloide acuta, un tipo di cancro che inizia nel midollo osseo, possono essere efficacemente distinte in base ai loro profili di attività proteica, utilizzando un numero relativamente piccolo di cellule.

I ricercatori hanno quindi rivolto la loro attenzione alle isole pancreatiche, che svolgono un ruolo centrale nel diabete. Questi gruppi di cellule producono ormoni, insulina e glucagone, che lavorano insieme per impedire che i livelli di glucosio nel sangue diventino troppo alti o troppo bassi. Le cellule sono bersagli nei pazienti con tipo 1, o insulino-dipendente, diabete. Però, l'attività proteica nelle isole umane è difficile da studiare a causa del loro contenuto proteico limitato. Utilizzando la nuova tecnica, i ricercatori hanno analizzato i cambiamenti nell'attività delle proteine ​​nelle isole umane in risposta al trattamento, un'aspirazione a lungo ricercata dai medici che monitorano i loro pazienti.

"Questo ci darà nuove informazioni su cosa succede quando le cellule che producono insulina muoiono nei pazienti con diabete, " disse Wei-Jun Qian, l'altro autore corrispondente dell'articolo e uno scienziato biomedico al PNNL. "La capacità di monitorare l'attività delle proteine ​​in modo più rigoroso ci aiuterà a capire quali percorsi di segnalazione sono coinvolti nella morte cellulare".

All'orizzonte

Il nuovo approccio è promettente per vari tipi di ricerca biologica e biomedica quando il materiale del campione è scarso. Gli usi potrebbero includere il confronto delle cellule prima e dopo il trattamento farmacologico, testare dosi diverse, o studiando i tempi di attivazione o disattivazione della proteina.

"Le possibilità sono infinite, " ha detto Liu. "Puoi fare una quantificazione su larga scala, e inoltre puoi fondere molte condizioni diverse che vuoi studiare in un unico esperimento."