Una delle principali sfide della produzione di biocarburanti di seconda generazione è identificare enzimi prodotti da microrganismi da utilizzare in un cocktail di enzimi per catalizzare l'idrolisi della biomassa in cui gli enzimi agiscono insieme per abbattere i carboidrati nella spazzatura della canna da zucchero e nella bagassa, Per esempio, e convertirli in zuccheri semplici per la fermentazione.

Un gruppo di ricercatori dell'Università di Campinas (UNICAMP), lavorando in collaborazione con i colleghi del Laboratorio nazionale brasiliano di biorinnovabili (LNBR) a Campinas, Stato di San Paolo, Brasile, ho scoperto che Trichoderma harzianum , un fungo trovato in Amazzonia, produce un enzima con il potenziale per svolgere un ruolo chiave nei cocktail enzimatici.

L'enzima, che si chiama β-glucosidasi e appartiene alla famiglia dei glicosidi idrolasi 1 (GH1), agisce nell'ultima fase della degradazione della biomassa per produrre glucosio libero per la fermentazione e la conversione in etanolo. In laboratorio, però, i ricercatori hanno osservato che alti livelli di glucosio inibiscono l'attività della β-glucosidasi.

"Abbiamo anche scoperto che l'attività catalitica ottimale dell'enzima si è verificata a 40 ° C. Questo ha rappresentato un altro ostacolo all'uso dell'enzima perché in un ambiente industriale, l'idrolisi enzimatica della biomassa viene eseguita a temperature più elevate, tipicamente intorno ai 50 °C, " disse Clelton Aparecido dos Santos, un ricercatore post-dottorato presso il Centro di Biologia Molecolare e Ingegneria Genetica (CBMEG) di UNICAMP con una borsa di studio FAPESP.

Sulla base di un'analisi della struttura dell'enzima combinata con tecniche di genomica e biologia molecolare, i ricercatori sono stati in grado di modificare la struttura per risolvere questi problemi e migliorare considerevolmente la sua efficienza di degradazione della biomassa.

Lo studio è il risultato di un progetto con un assegno di ricerca regolare da FAPESP e un progetto tematico sostenuto anche da FAPESP. I risultati sono pubblicati sulla rivista Rapporti scientifici .

"La proteina modificata che abbiamo sviluppato si è dimostrata molto più efficiente dell'enzima non modificato e può essere utilizzata per integrare i cocktail di enzimi venduti oggi per abbattere la biomassa e produrre biocarburanti di seconda generazione, " ha detto Santos.

Per arrivare alla proteina modificata, i ricercatori hanno inizialmente confrontato la struttura cristallina della molecola originale con le strutture di altre -glucosidasi wild-type nelle famiglie di glicosidi idrolasi GH1 e GH3. I risultati dell'analisi hanno mostrato che le glucosidasi GH1 tolleranti al glucosio avevano un canale substrato più profondo e stretto rispetto alle altre β-glucosidasi e che questo canale limitava l'accesso del glucosio al sito attivo dell'enzima.

Le β-glucosidasi meno tolleranti al glucosio avevano un canale di ingresso al sito attivo più superficiale ma più ampio, consentendo a una parte maggiore del glucosio prodotto da questi enzimi di entrare nell'ultima fase della degradazione della biomassa. Il glucosio trattenuto blocca il canale della proteina e riduce la sua attività catalitica.

Sulla base di questa osservazione, i ricercatori hanno utilizzato una tecnica di biologia molecolare nota come mutagenesi sito-diretta per sostituire due amminoacidi che potrebbero agire come "custodi" all'ingresso del sito attivo dell'enzima, lasciando entrare il glucosio o bloccandolo. L'analisi dei loro esperimenti ha mostrato che la modifica ha ristretto il canale al sito attivo.

"Il sito attivo dell'enzima mutante si è ridotto a una dimensione simile a quella delle GH1 -glucosidasi tolleranti al glucosio, " ha detto Santos.

Efficienza migliorata

I ricercatori hanno condotto una serie di esperimenti per misurare le prestazioni migliorate della proteina nella scomposizione della biomassa, soprattutto bagassa di canna da zucchero, uno scarto agroindustriale con un vasto potenziale di utilizzo redditizio in Brasile. Durante uno stage di ricerca all'estero con una borsa di studio della São Paulo Research Foundation—FAPESP, Santos ha lavorato con un gruppo di ricerca guidato da Paul Dupree, professore all'Università di Cambridge nel Regno Unito, su un'analisi dell'efficienza di rilascio del glucosio dell'enzima su misura quando sono state convertite diverse fonti di biomassa vegetale.

L'analisi ha mostrato che l'efficienza catalitica dell'enzima modificato era del 300% superiore a quella dell'enzima wild-type in termini di rilascio di glucosio. Inoltre, era più tollerante al glucosio, quindi più glucosio è stato rilasciato da tutte le materie prime della biomassa vegetale testate. La mutazione ha anche migliorato la stabilità termica dell'enzima durante la fermentazione.

"La mutazione dei due amminoacidi nel sito attivo ha reso l'enzima superefficiente. È pronto per l'applicazione industriale, " disse Anete Pereira de Souza, un professore di UNICAMP e ricercatore principale per il progetto. "Uno dei vantaggi dell'enzima è che è prodotto in vitro e non da un fungo modificato o da un altro organismo, quindi può essere prodotto in serie a un costo relativamente basso."