Nelle reazioni chimiche catalizzate da un enzima, l'enzima riduce la quantità di energia di attivazione richiesta legando temporaneamente con il substrato e torcendolo in uno stato teso. Il k (catalizzatore) o "kcat" per la reazione si riferisce alla costante indipendente dalla concentrazione per la velocità con cui un particolare enzima può metabolizzare un substrato in una molecola di prodotto. Per calcolare kcat, gli scienziati prima mischiano diverse provette con diverse concentrazioni di substrato (noto come un "saggio enzimatico") e li testano a intervalli di tempo costanti con uno spettrofotometro leggero per misurare le crescenti concentrazioni di molecole di prodotto. Questi dati vengono quindi tracciati su un grafico e analizzati.

Calcolo delle velocità iniziali

Tracciare un grafico della concentrazione del prodotto in funzione del tempo per i dati della prima provetta del test enzimatico. Nota: l'asse orizzontale dovrebbe essere "tempo" e l'asse verticale dovrebbe essere "concentrazione prodotto".

Calcolare la linea di regressione lineare per i punti dati tracciati nella Sezione 1, Passaggio 1. Mentre Excel e grafica i calcolatori possono facilmente determinare questo modello lineare, è possibile ricavare una stima della pendenza della linea di regressione dividendo la differenza di concentrazione del prodotto tra i punti dati adiacenti per la loro differenza di tempo.

Registrare la pendenza della linea di regressione lineare da Sezione 1, Passaggio 2 come "velocità di reazione iniziale (Vo)." Nota: nel modello di linea di regressione "[concentrazione prodotto] = m [tempo] + b", il coefficiente "m" è la pendenza.

Ripetere i passaggi 1, 2 e 3 per il resto delle provette nel dosaggio.

Calcolo di Vmax

Traccia l'inverso della concentrazione del substrato per ciascuna provetta rispetto all'inverso della sua velocità di reazione iniziale (dalla Sezione 1, Passaggio 4). Ad esempio, se la velocità iniziale per una provetta con una concentrazione iniziale del substrato di 50 micromolar (uM) era 80 μM /s, gli inversi sarebbero 1/50 uM per la concentrazione del substrato e 1/80 uM /s per l'iniziale velocità. Nota: la concentrazione del substrato inverso dovrebbe essere sull'asse orizzontale e la velocità iniziale inversa dovrebbe essere sull'asse verticale.

Nota: la concentrazione del substrato dovrebbe essere sull'asse orizzontale e la velocità di reazione iniziale dovrebbe essere sul asse verticale.

Determina la linea di regressione lineare per il grafico tracciato nella sezione 2, passaggio 1. Nota: poiché dovrai conoscere l'intersezione y per la linea di regressione, devi inserire i punti dalla sezione 2, Passaggio 1 in Excel o in una calcolatrice grafica e utilizzare la funzionalità di modellazione della regressione incorporata.

Dividere 1 dall'intersezione y dalla linea di regressione lineare. Questo ti darà il valore dell'inversa della Vmax, la massima velocità di reazione per l'enzima. Nota: se il modello di regressione lineare assume la forma "[Vo Inversa] = m [Conc. Substrato Inverso] + b", allora il valore di "b" sarebbe l'intersezione y. Dividi 1 per "b" per calcolare l'inverso di Vmax.

Dividi 1 dal risultato della Sezione 2, Passaggio 3 per calcolare il valore effettivo di Vmax.

Determina la concentrazione dell'enzima nel saggio originale (vedi i dati grezzi). Nota: la concentrazione dell'enzima è la stessa per tutte le provette; solo le concentrazioni del substrato variano nel dosaggio.

Dividere il Vmax (dalla Sezione 2, Passaggio 4) per la concentrazione dell'enzima (dalla Sezione 2, Passaggio 5). Il risultato è il valore di Kcat.