Mappatura delle cellule dalle linee di topi knock-out DNMT all'atlante di riferimento (grigio) con cellule wild-type indicate in blu e cellule knock-out indicate in rosso. Credito:Istituto Babraham
La ricerca che applica tecniche di analisi unicellulare e confronti a una risorsa di atlante cellulare ha consentito ai ricercatori del Babraham Institute di collegare i difetti di sviluppo osservati causati da processi di metilazione del DNA interrotti con una comprensione dei tipi cellulari interessati. Questo lavoro, pubblicato in Biologia del genoma , si basa sul lavoro precedente intrapreso con i collaboratori per stabilire un atlante cellulare dettagliato che traccia il destino cellulare durante lo sviluppo iniziale. Questo lavoro contribuisce a nuove importanti conoscenze per comprendere il ruolo della metilazione del DNA durante l'embriogenesi, aiutando a decifrare le regole che regolano il modo in cui sorgono i diversi tipi cellulari. La comprensione di queste regole sarà essenziale affinché i ricercatori siano in grado di dirigere in modo accurato e sicuro il destino cellulare per produrre tipi cellulari clinicamente rilevanti per la medicina rigenerativa.
La ricerca del Reik labat del Babraham Institute ha migliorato la nostra comprensione del ruolo della metilazione del DNA durante le prime fasi di sviluppo. I progressi tecnologici in questo campo, fornendo la possibilità di raccogliere tipi di dati paralleli da una singola cella e l'esistenza di riferimenti all'atlante cellulare e set di dati completi, stanno rivoluzionando ciò che sappiamo sui processi che determinano il destino delle cellule. Il chiarimento delle regole su come si formano i diversi tipi cellulari ha applicazioni nella medicina rigenerativa e nella comprensione dei disturbi e delle malattie dello sviluppo.
È noto che la cancellazione e la reintroduzione della metilazione del DNA sono vitali per stabilire l'identità cellulare quando si formano i tessuti e gli organi dell'embrione. L'eliminazione degli enzimi chiave di metilazione nei topi provoca in alcuni casi gravi difetti dello sviluppo e letalità embrionale. Nonostante l'importanza della metilazione del DNA nello sviluppo, i meccanismi alla base di come ciò viene raggiunto sono poco conosciuti. Ciò è dovuto alle limitazioni sulle informazioni che i ricercatori potevano raccogliere in precedenza per comprendere gli effetti dei cambiamenti nei normali processi di metilazione del DNA in fase di sviluppo, che era limitato all'analisi dei difetti dello sviluppo, all'imaging del campione e all'analisi limitata dell'intero genoma utilizzando campioni ammassati. Questi metodi non erano sufficienti per risolvere gli effetti a livello di diversi tipi cellulari.
Utilizzando topi in cui sono stati eliminati gli enzimi di metilazione chiave, i ricercatori del laboratorio Reik nel programma di epigenetica dell'Istituto hanno eseguito l'analisi dell'espressione genica unicellulare all'inizio dello sviluppo dell'organo, che si verifica al giorno 8,5 dopo la fecondazione. Utilizzando la potenza degli approcci unicellulari, i ricercatori sono stati in grado di seguire quali tipi cellulari sono stati colpiti, in termini di impossibilità di formarsi nell'embrione di topo, suggerendo i meccanismi alla base degli effetti osservati su scala dell'intero organismo.
La ricerca ha utilizzato topi geneticamente modificati in cui sono stati eliminati due gruppi chiave di enzimi di metilazione:linee di topi knock-out in cui le DNA metiltransferasi (DNMT 1, 3a e 3b) che introducono e mantengono la metilazione del DNA sono state eliminate individualmente e un sistema per studiare gli effetti di una delezione combinata di tutti e tre gli enzimi TET (dieci undici traslocazioni (TET) metilcitosina diossigenasi) 1/2/3), che causano la demetilazione.
Il dottor Stephen Clark, ricercatore senior nel laboratorio Reik quando è stata intrapresa questa ricerca, ha affermato:"L'uso di approcci unicellulari sta davvero fornendo la risoluzione di cui abbiamo bisogno per studiare la meccanica della metilazione del DNA durante lo sviluppo. L'immagine che siamo stati in grado di per costruire conferma il ruolo repressivo della metilazione del DNA in questo momento dello sviluppo, in primo luogo che è necessario mantenere la corretta metilazione del DNA per sopprimere identità di tipo cellulare passate e alternative e in secondo luogo che la metilazione del DNA deve essere rimossa da parti del genoma per consentire a determinate cellule tipi da formare."
Una tecnica chiamata sequenziamento dell'RNA unicellulare è stata utilizzata per misurare l'espressione genica attraverso il genoma in ciascuna linea di topi. Il confronto di questi profili di espressione con un set di dati di riferimento ha consentito di identificare tutti i tipi cellulari dell'embrione. A seguito di tale passaggio, l'effetto delle perturbazioni della metilazione sul destino cellulare potrebbe essere valutato confrontando la composizione degli embrioni knock-out (in cui gli enzimi di metilazione sono stati eliminati) con gli embrioni di tipo selvaggio nella stessa fase di sviluppo per evidenziare le differenze nel tipo di cellula proporzioni.
I ricercatori sono stati in grado di correlare gli effetti sulla formazione del tipo cellulare al giorno 8,5 di sviluppo che corrispondevano ai fenotipi osservati e analizzare i cambiamenti specifici del tipo cellulare nell'espressione genica che potrebbero essere collegati a difetti nell'impegno del destino cellulare.
Il dottor Ricard Argelaguet, un ex ricercatore post-dottorato nel laboratorio Reik dell'Istituto e co-primo autore dell'articolo, ha affermato:"La capacità di avere sia la prospettiva dell'intero organismo che la granularità di osservare i cambiamenti nei tipi cellulari e nell'espressione genica ci ha fornito la capacità di distinguere il ruolo della metilazione e demetilazione del DNA nell'embrione in via di sviluppo in questo momento particolare per creare nuove intuizioni.Sarà ugualmente interessante applicare questo approccio a punti temporali successivi per capire di più sul ruolo della metilazione del DNA con il progredire dello sviluppo."
La ricerca ha creato una piattaforma dati interattiva che fornisce letture dell'espressione genica a livello unicellulare da embrioni di topi mutanti Dnmt e Tet.
Il professor Wolf Reik, direttore dell'Altos Cambridge Institute of Science, che ha condotto la ricerca mentre era leader del gruppo nel programma di epigenetica presso il Babraham Institute, ha dichiarato:"Questa ricerca fornisce una ricca risorsa per sondare la connessione tra la metilazione del DNA e l'instaurazione di destino cellulare Questa ricerca ha beneficiato di set di dati pubblicati e atlanti di riferimento e speriamo che a sua volta il nostro lavoro sia utile ad altri ricercatori sia nel campo dello sviluppo che nell'epigenetica". + Esplora ulteriormente
