Una nuova variazione del sistema di editing genetico CRISPR-Cas9 rende più facile riprogettare enormi quantità di cellule per applicazioni terapeutiche. L'approccio, sviluppato presso il Gladstone Institutes e l'UC San Francisco (UCSF), consente agli scienziati di introdurre sequenze di DNA particolarmente lunghe in posizioni precise nei genomi delle cellule con efficienze notevolmente elevate senza i sistemi di rilascio virale che sono stati tradizionalmente utilizzati per trasportare il DNA nelle cellule.

"Uno dei nostri obiettivi per molti anni è stato quello di inserire lunghe istruzioni sul DNA in un sito mirato nel genoma in un modo che non dipenda dai vettori virali", afferma Alex Marson, MD, Ph.D., direttore del Gladstone -UCSF Institute of Genomic Immunology e autore senior del nuovo studio. "Questo è un enorme passo avanti verso la prossima generazione di terapie cellulari sicure ed efficaci."

Nel nuovo articolo pubblicato sulla rivista Nature Biotechnology , Marson e i suoi colleghi non solo descrivono la tecnologia, ma mostrano come può essere utilizzata per generare cellule CAR-T con il potenziale per combattere il mieloma multiplo, un cancro del sangue, nonché per riscrivere sequenze geniche in cui le mutazioni possono portare a malattie immunitarie ereditarie rare malattie.

"Abbiamo dimostrato che possiamo progettare più di un miliardo di cellule in una singola corsa, che è ben al di sopra del numero di cellule di cui abbiamo bisogno per trattare un singolo paziente", afferma il primo autore Brian Shy, MD, Ph.D., un collega clinico nel laboratorio di Marson.

Dal DNA a filamento doppio a quello singolo

CRISPR-Cas9, un sistema che modifica i geni all'interno delle cellule viventi, è stato utilizzato come strumento di ricerca di base negli ultimi dieci anni. Sempre più scienziati clinici sono entusiasti del potenziale di CRISPR-Cas9 per generare terapie con cellule viventi.

Con l'editing genetico, è possibile disattivare, eliminare o sostituire un gene mutato che causa una malattia o aumentare l'attività di lotta contro il cancro di una cellula immunitaria, tra le altre cose. Sebbene le prime applicazioni terapeutiche di CRISPR-Cas9 siano recentemente entrate in studi clinici, la tecnologia è ancora limitata dalla sfida di produrre in sicurezza grandi quantità di cellule correttamente modificate.

Tradizionalmente, i ricercatori hanno fatto affidamento su vettori virali - i gusci dei virus senza i loro componenti che causano malattie - per trasportare il DNA (chiamato modello di DNA) utilizzato per la terapia genica nelle cellule. Tuttavia, la produzione di grandi quantità di vettori virali di livello clinico è stato un importante collo di bottiglia nell'offerta di terapie cellulari ai pazienti. Inoltre, i ricercatori non possono controllare facilmente dove i vettori virali tradizionali inseriscono i geni all'interno del genoma.

"L'uso di vettori virali è costoso e richiede molte risorse", afferma Shy. "Uno dei principali vantaggi di un approccio non virale all'ingegneria genetica è che non siamo così limitati da costi, complessità di produzione e sfide della catena di approvvigionamento".

Nel 2015, il gruppo di Marson, in collaborazione con il laboratorio della pioniera del CRISPR Jennifer Doudna, Ph.D., ha dimostrato per la prima volta di poter inserire brevi modelli di DNA nelle cellule immunitarie senza vettori virali, utilizzando un campo elettrico che rende le membrane esterne delle cellule più permeabili . Entro il 2018, hanno sviluppato un metodo per tagliare e incollare sequenze di DNA più lunghe nelle cellule immunitarie con CRISPR e lo hanno pubblicato su Natura .

Quindi, nel 2019, i ricercatori hanno scoperto che, utilizzando anche una versione modificata dei modelli di DNA che possono legarsi all'enzima Cas9, la stessa proteina che agisce come forbici molecolari durante l'editing del gene CRISPR, potrebbero fornire le nuove sequenze al genoma mirato sito in modo più efficiente. Quel lavoro è stato pubblicato su Nature Biotechnology .

Tuttavia, è stato necessario più lavoro per migliorare la resa delle cellule immunitarie ingegnerizzate con successo e per rendere il processo compatibile con la produzione di future terapie cellulari. Questi obiettivi hanno motivato l'attuale studio del team.

Il DNA può esistere in filamenti singoli o doppi (come pezzi opposti di velcro) e Cas9 si attacca al DNA a doppio filamento. I ricercatori hanno rapidamente scoperto che alti livelli di stampo di DNA a doppio filamento possono essere tossici per le cellule, quindi il metodo può essere utilizzato solo con basse quantità di DNA stampo, portando a una bassa efficienza.

Il team sapeva che il DNA a filamento singolo era meno tossico per le cellule, anche a concentrazioni relativamente elevate. Quindi, nel nuovo articolo, descrivono un metodo per attaccare l'enzima Cas9 modificato a un DNA modello a singolo filamento, aggiungendo solo una piccola sporgenza di DNA a doppio filamento alle estremità.

"Questo ci offre un approccio equilibrato, il migliore dei due mondi", afferma Marson.

Il DNA modello a filamento singolo potrebbe più che raddoppiare l'efficienza dell'editing genetico rispetto al vecchio approccio a doppio filamento. E le estremità a doppio filamento delle molecole consentono ai ricercatori di utilizzare Cas9 per migliorare la consegna di vettori non virali nelle cellule.

"Questa tecnologia ha il potenziale per rendere le nuove terapie cellulari e geniche più veloci, migliori e meno costose", afferma Jonathan Esensten, MD, Ph.D., autore del nuovo lavoro che è un assistente professore di medicina di laboratorio all'UCSF e un investigatore affiliato a Gladstone.

Un percorso verso la clinica

Nello studio, i ricercatori hanno utilizzato il nuovo modello di DNA per generare più di un miliardo di cellule CAR-T che colpiscono il mieloma multiplo. Le cellule CAR-T sono cellule T immunitarie geneticamente modificate per combattere efficacemente cellule o tumori specifici. Con i nuovi modelli a filamento singolo diretti da Cas9, circa la metà di tutte le cellule T ha acquisito il nuovo gene e, di conseguenza, è stata convertita in cellule CAR-T.

"Sapevamo che il targeting dei modelli di DNA in una posizione specifica nel genoma, chiamato sito TRAC, avrebbe migliorato la potenza antitumorale delle cellule CAR-T", afferma Justin Eyquem, Ph.D., coautore del nuovo articolo, assistente professore di medicina presso la Divisione di Ematologia e Oncologia presso l'UCSF e ricercatore affiliato presso Gladstone. "Questo nuovo approccio non virale ci consente di raggiungere questo obiettivo in modo molto più efficiente, il che accelererà lo sviluppo della prossima generazione di terapie cellulari CAR-T".

Inoltre, i ricercatori hanno dimostrato che il loro approccio potrebbe, per la prima volta, sostituire nella loro interezza due geni associati a malattie immunitarie genetiche rare, i geni IL2RA e CTLA4.

In passato, gli scienziati avevano dimostrato che potevano sostituire piccole sezioni del gene IL2RA in cui particolari pazienti presentavano mutazioni. Ora, il team di Marson ha dimostrato di poter sostituire l'intero gene IL2RA e CTLA4 contemporaneamente, un approccio "taglia unica" che potrebbe trattare molti pazienti con diverse mutazioni in questi geni, piuttosto che dover generare modelli personalizzati per la mutazione di ciascun paziente. Quasi il 90 percento delle cellule trattate con questo approccio di ingegneria genetica ha ottenuto le versioni sane dei geni.

I ricercatori stanno ora cercando l'approvazione per far avanzare gli studi clinici utilizzando la tecnologia CRISPR non virale sia nella terapia cellulare CAR-T che nel trattamento del deficit di IL2RA. + Esplora ulteriormente

Lo studio incoraggia un approccio prudente alle terapie CRISPR