1. Lisi cellulare:
* Apri le celle: Questo è il primo passo, in cui la membrana cellulare e la membrana nucleare vengono interrotti per rilasciare il DNA.
* Metodi meccanici: Questi includono l'uso di un frullatore (per campioni più grandi), sonicazione (usando onde sonore) o macinare le cellule (per i tessuti).
* Metodi chimici: Usando detergenti (come SDS) o enzimi (come il lisozima) per abbattere le membrane cellulari.
2. Isolamento del DNA:
* Separazione del DNA da altri componenti cellulari: Dopo la lisi, la miscela contiene DNA, proteine, lipidi e altri detriti cellulari.
* Digestione enzimatica: Gli enzimi come la proteinasi K sono usati per abbattere le proteine, separando ulteriormente il DNA da altri componenti cellulari.
* PRECCITAZIONE DI SALE: L'aggiunta di soluzioni di sale come il cloruro di sodio può far precipitare il DNA dalla soluzione, mentre altri componenti cellulari rimangono sciolti.
* Estrazione organica: Usando solventi organici come fenolo-cloroformio per separare il DNA da proteine e altri componenti cellulari. Il DNA rimane nella fase acquosa, mentre gli altri componenti vengono estratti nella fase organica.
3. Purificazione del DNA:
* Rimozione dei contaminanti: Dopo l'isolamento, il DNA potrebbe ancora contenere impurità come l'RNA o le proteine.
* precipitazione di etanolo: L'aggiunta di etanolo alla soluzione fa precipitare il DNA, consentendo un'ulteriore purificazione.
* Cromatografia a colonna: Utilizzando colonne specializzate con resine specifiche che si legano al DNA, consentendo la rimozione selettiva dei contaminanti.
4. Storage DNA:
* memorizzazione del DNA purificato: Il DNA isolato può essere conservato in tamponi a temperature specifiche per l'uso a lungo termine.
Considerazioni aggiuntive:
* Tipo di cella: Il metodo utilizzato dipenderà dal tipo di cellula studiata, ad esempio, le cellule batteriche sono più facili da lisare rispetto alle cellule di mammifero.
* quantità di DNA necessaria: La quantità di DNA necessaria influirà sul metodo scelto.
* Applicazioni a valle: L'uso previsto del DNA (ad es. Sequenziamento, PCR, clonazione) potrebbe richiedere fasi di purificazione specifiche.
Esempio:
Un metodo comune per estrarre il DNA dal sangue implica:
1. Lisi: Il sangue viene miscelato con un tampone di lisi contenente detergenti ed enzimi per aprire le cellule e rilasciare il DNA.
2. Rimozione della proteina: La proteinasi K viene aggiunta per digerire le proteine e separare ulteriormente il DNA.
3. Centrifugazione: La miscela viene filata in una centrifuga per separare il DNA da altri componenti cellulari.
4. precipitazione di etanolo: L'etanolo viene aggiunto per precipitare il DNA, che viene quindi raccolto mediante centrifugazione.
5. Lavaggio e conservazione: Il pellet di DNA viene lavato per rimuovere eventuali contaminanti rimanenti e conservato in una soluzione tampone.
Questa panoramica semplificata evidenzia i passaggi chiave coinvolti nell'estrazione del DNA. Esistono variazioni e ottimizzazioni di questi metodi a seconda dei requisiti sperimentali specifici.
