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La clonazione molecolare è una tecnica fondamentale nella biologia moderna che ogni studente e ricercatore dovrebbe padroneggiare. Utilizzando enzimi di restrizione, gli scienziati hanno tagliato il DNA a doppio filamento in frammenti gestibili che possono poi essere inseriti in un vettore plasmidico ed espressi in un ospite batterico.
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che legano specifiche brevi sequenze di DNA, chiamate siti di restrizione, e fendono la struttura fosfodiesterica proprio in quelle posizioni. Con oltre 90 enzimi distinti catalogati, ognuno prende di mira una sequenza unica e taglia il suo sito fino a 5.000 volte più velocemente di qualsiasi sequenza non riconosciuta.
Quando un enzima di restrizione taglia, i terminali risultanti possono essere estremità appiccicose o estremità smussate . Le estremità adesive contengono sporgenze a filamento singolo complementari tra loro; questa “viscosità” determina un accoppiamento rapido e specifico tra due frammenti. Le estremità smussate, al contrario, hanno fili perfettamente accoppiati senza sporgenze, il che le rende meno selettive durante la legatura.
Poiché le estremità appiccicose si accoppiano solo con le loro sporgenze complementari, il frammento inserito può entrare nel plasmide con un unico orientamento definito. Le estremità smussate non offrono tale controllo direzionale, consentendo al frammento di legarsi nell'orientamento testa-coda o coda-testa.
Sebbene sia le estremità appiccicose che quelle smussate alla fine richiedano la DNA ligasi per formare un filamento continuo, le estremità appiccicose riducono la quantità di DNA necessaria per una reazione riuscita. Le loro sporgenze complementari si trovano l'una con l'altra in modo più rapido ed efficiente, consentendo alla legatura di procedere con concentrazioni inferiori di inserto e vettore.
Al contrario, le estremità smussate devono fare affidamento esclusivamente sulla concentrazione di molecole di DNA per collidere e allinearsi, il che spesso richiede quantità di input più elevate per ottenere efficienze di legatura comparabili.
Una delle caratteristiche più potenti degli enzimi appiccicosi è che diversi enzimi possono generare sporgenze identiche, anche se riconoscono sequenze distinte. Ad esempio, BamHI , BglII e Sau3A producono tutti la stessa sporgenza appiccicosa di 5'-GATC-3'. Questa ridondanza aumenta la probabilità che una coppia di siti adatti fiancheggi un gene di interesse, offrendo ai ricercatori flessibilità nella scelta della strategia di restrizione ottimale.
I plasmidi ingegnerizzati possono anche posizionare siti di restrizione adiacenti tra loro, migliorando ulteriormente la versatilità dei progetti di clonazione.
