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Determinare la concentrazione di cellule in un campione liquido è un compito di routine ma essenziale nei laboratori clinici e di ricerca. Conteggi cellulari accurati informano i medici sullo stato immunitario del paziente, aiutano a diagnosticare le infezioni e guidano le valutazioni della fertilità. Nella ricerca, consentono agli scienziati di quantificare batteri, lieviti e altri microrganismi per studi ecologici o processi industriali. Il metodo più comune e affidabile per il conteggio delle cellule è l'emocitometro, una camera di conteggio precisa ampiamente insegnata nei corsi di biologia e utilizzata nei laboratori professionali di tutto il mondo.
Quando una sospensione cellulare contiene milioni di cellule, il conteggio diretto diventa poco pratico perché le cellule si sovrappongono e non possono essere distinte. Per ottenere una diluizione adeguata, trasferire 10 µl della soluzione originale in una provetta sterile contenente 90 µl di un diluente appropriato (ad esempio soluzione salina tamponata con fosfato o terreno di coltura). Mescolare accuratamente; questo crea una diluizione di dieci volte (fattore di diluizione=10⁻¹). Etichettare la provetta e ripetere la procedura finché il campione non sarà sufficientemente diluito per un conteggio accurato. Ogni ulteriore diluizione decuplicata moltiplica il fattore di diluizione per 10 (ad esempio, una seconda diluizione dà 10⁻², una terza 10⁻³).
L'emocitometro è una camera piccola e trasparente con una griglia incisa sulla superficie inferiore. La sua profondità è generalmente di 0,1 mm e la griglia è divisa in quadrati grandi e piccoli le cui aree sono rispettivamente di 1 mm² e 0,04 mm². Pipettare un piccolo volume della sospensione diluita nel pozzetto della camera. L'azione capillare diffonde il liquido attraverso la griglia. Posiziona la camera su un tavolino da microscopio e osservala a basso ingrandimento (×10–×40).
Scegli uno schema di quadrati conveniente, in genere i quattro angoli e un quadrato centrale, per contare almeno 100 celle. Per celle grandi, utilizzare i quadrati più grandi; per le celle più piccole, conta i quadrati più piccoli. Registra il numero di celle in ciascun quadrato selezionato.
Ogni quadrato grande ha un volume di 0,1 mm³ (0,1 mm×1 mm²). Se hai contato 103 celle su cinque grandi quadrati, il volume totale conteggiato è 0,5 mm³. Raddoppiando questo volume per rappresentare 1 mm³ completo si ottengono 206 celle. Poiché 1 ml equivale a 1 cm³ e contiene 1.000 mm³, la concentrazione nel campione diluito è:
Formula:Volume dell'area conteggiata×numero di quadrati =volume conteggiato totale
Celle ÷ volume totale conteggiato =celle per mm³
cellule per mm³×1.000 =cellule per ml
Regolare in base al fattore di diluizione utilizzato durante la preparazione. Per un fattore di diluizione di 10⁻² (ovvero 1:100), la concentrazione del campione originale è:
Pertanto, la sospensione iniziale non diluita conteneva circa 20,6 milioni di cellule per millilitro.
