Di Palmer Owyoung · Aggiornato il 24 marzo 2022
I batteri vengono coltivati su agar in piastre Petri, formando colonie visibili che rappresentano gruppi di cellule. Mentre un semplice conteggio delle colonie può fornire una stima rapida della carica batterica, i metodi quantitativi come i conteggi su piastre vitali forniscono sia numeri assoluti che informazioni qualitative su come le diverse condizioni influenzano la crescita. Poiché una singola piastra può contenere miliardi di cellule, la coltura deve prima essere diluita in serie fino a un livello tale da poter contare in modo affidabile le singole colonie.
Iniziare con una provetta sterile da 1,5 ml. Pipettare 10 µl della coltura iniziale in 90 µl di mezzo di diluizione sterile (ad esempio soluzione salina tamponata con fosfato). Sigillare la provetta, agitarla delicatamente nel vortex e ottenere una diluizione 10⁻¹. Ripetere il trasferimento di 10 µL in 90 µL di terreno fresco per generare una diluizione 10⁻² e così via. Proseguire fino a raggiungere una diluizione compresa tra 10⁻⁴ e 10⁻¹⁰. Etichetta ciascuna provetta (10‑1, 10‑2, …) per tenere traccia del fattore di diluizione.
Prelevare 10 µl dalla provetta più diluita che produce ancora colonie numerabili (tipicamente 30–300 per piastra). Distribuire uniformemente l'inoculo sulla superficie dell'agar con una spatola in vetro, ruotare la piastra di 90° e ripetere. Preparare almeno tre piastre per diluizione per garantire la confidenza statistica. Lasciare asciugare lo spanditore su una fiamma o su un banco per alcuni minuti, quindi rimettere i coperchi e incubare alla temperatura ottimale per l'organismo (solitamente 35–37°C) per 12–16 ore.
Dopo l'incubazione, ispezionare ciascuna piastra per verificare la presenza di un numero numerabile di colonie. Segna il fondo del piatto (non il coperchio) con un pennarello indelebile nella posizione di ciascuna colonia e conta i punti. Scegli piastre che contengono tra 30 e 300 colonie per statistiche accurate.
Calcolare le unità formanti colonie (CFU) per millilitro della coltura originale utilizzando la formula:
CFU/mL = (numero di colonie) × 10×10ⁿ
dove n è l'esponente negativo del fattore di diluizione (ad esempio, per una diluizione 10⁻⁷, n = 7). Il fattore 10 rappresenta il volume di inoculo di 10μL.
Sterilizzare lo spargitore in etanolo al 70%, accenderlo con la fiamma di un becco Bunsen, lasciare bruciare l'alcol e raffreddarlo sulla superficie dell'agar asciutta. Questo uccide eventuali microbi residui prima della placcatura.
Trattare tutte le colture batteriche come potenzialmente pericolose. Seguire le linee guida istituzionali sulla biosicurezza e utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati.
