Immagini di fluorescenza confocale di superfici in vetro rivestite con i coloranti cianina Alexa Fluor 647 (a) e CF660C (b) e con colorante carborodamina ATTO647N (c) dopo eccitazione della luce a 568 nanometri (nm). Eccitando i coloranti che assorbono il rosso a 640 nm in determinate aree (immagini negative in alto a destra), i coloranti sono fotoconvertiti lì ed è possibile scrivere lettere sulla superficie che sono state eccitate a 568 nm e fluorescenti a circa 580 nm. Il colorante alla carborodamina mostra un fotoazzurramento più efficiente rispetto ai coloranti alla cianina. Credito:Team Markus Sauer / Università di Würzburg
Gli ultimi sviluppi nella microscopia a fluorescenza rendono possibile l'immagine di singole molecole in cellule o complessi molecolari con una risoluzione spaziale fino a 20 nanometri. Però, in determinate circostanze, si verifica un effetto che falsifica i risultati:la luce laser utilizzata può causare la formazione di molecole di ossigeno molto reattive nel campione. Questi possono quindi danneggiare i coloranti fluorescenti utilizzati in misura tale da non renderli più fluorescenti. Tra gli esperti di microscopia, questo effetto è noto come photobleaching.
Però, vari coloranti fluorescenti possono anche essere trasformati mediante fotosbiancamento in modo che assorbano la luce di lunghezze d'onda più corte. "Un colorante fluorescente precedentemente rosso diventa quindi verde. La sua fluorescenza è stata spostata verso la gamma blu sulla scala delle lunghezze d'onda. Questo è il motivo per cui questo effetto è chiamato fotoazzurramento, " spiega il professor Markus Sauer, un esperto in microscopia a super risoluzione del Biocentro della Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) in Baviera, Germania.
Prima descrizione esatta del photoblueing
Il team di Sauer presenta ora per la prima volta nella rivista l'esatto meccanismo molecolare del fotoazzurramento per i coloranti cianinati come Cy5 Metodi della natura . Anche il Dr. Martin Schnermann del Center for Cancer Research di Frederick (USA) è coinvolto nella pubblicazione.
"Poiché abbiamo capito il meccanismo in modo così preciso, siamo stati in grado di prevenire il fotoazzurramento con semplici additivi come la vitamina C o di aumentarlo aggiungendo una sorta di catalizzatore, "dice Markus Sauer.
Prevenire il photoblueing può essere molto importante. Sebbene l'effetto possa interessare solo una piccola percentuale del colorante utilizzato, può tuttavia portare a errori o interpretazioni errate della microscopia, per esempio negli esperimenti di trasferimento di energia (FRET). Questo perché i coloranti convertiti vengono rilevati con la stessa elevata sensibilità dei prodotti di partenza.
Buffer semplici impediscono il fotoblueing
"I nostri risultati mostrano quali coloranti sono interessati e come il fotoazzurramento può essere prevenuto con semplici aggiunte di tampone, "Sauer dice, per quanto riguarda il contenuto del Metodi della natura carta. "Ma mostrano ugualmente come il photoblueing possa essere utilizzato vantaggiosamente per l'imaging a fluorescenza e per il tracciamento di singoli, molecole di colorante specificamente convertite."
Questo è esattamente ciò che il team di Sauer intende affrontare in seguito:Photoblueing deve essere ulteriormente sviluppato per, tra l'altro, il monitoraggio mirato di singole particelle batteriche e virali nei processi di infezione. Il lavoro qui descritto è stato finanziato dalla German Research Foundation DFG.
