Gli scienziati del Broad Institute e del MIT che per primi hanno sfruttato CRISPR per l'editing del genoma dei mammiferi hanno progettato un nuovo sistema molecolare per l'editing efficiente dell'RNA nelle cellule umane. modifica dell'RNA, che possono alterare i prodotti genici senza apportare modifiche al genoma, ha un profondo potenziale come strumento sia per la ricerca che per il trattamento delle malattie.

In un articolo pubblicato oggi in Scienza , l'autore senior Feng Zhang e il suo team descrivono il nuovo sistema basato su CRISPR, chiamato RNA Editing per la sostituzione programmabile da A a I, o "RIPARAZIONE". Il sistema può modificare singoli nucleosidi di RNA nelle cellule di mammifero in modo programmabile e preciso. REPAIR ha la capacità di invertire le mutazioni che causano malattie a livello di RNA, così come altre potenziali applicazioni terapeutiche e scientifiche di base.

"La capacità di correggere le mutazioni che causano malattie è uno degli obiettivi primari dell'editing del genoma, "disse Zhang, un membro principale dell'istituto presso il Broad Institute e ricercatore presso il McGovern Institute for Brain Research del MIT. "Finora, siamo diventati molto bravi a inattivare i geni, ma in realtà recuperare la funzione proteica persa è molto più impegnativo. Questa nuova capacità di modificare l'RNA apre più potenziali opportunità per recuperare quella funzione e curare molte malattie, in quasi ogni tipo di cella."

REPAIR ha la capacità di indirizzare singole lettere di RNA, o nucleosidi, passare da adenosine a inosine (lette dalla cellula come guanosine). Queste lettere sono coinvolte in cambiamenti a base singola noti per causare regolarmente malattie negli esseri umani. Nella malattia umana, una mutazione da G ad A è estremamente comune; queste alterazioni sono state implicate in, Per esempio, casi di epilessia focale, Distrofia muscolare di Duchenne, e il morbo di Parkinson. REPAIR ha la capacità di invertire l'impatto di qualsiasi mutazione patogena da G ad A indipendentemente dalla sequenza nucleotidica circostante, con la possibilità di operare in qualsiasi tipo di cellula.

A differenza delle modifiche permanenti al genoma necessarie per l'editing del DNA, L'editing dell'RNA offre un modo più sicuro, modo più flessibile per apportare correzioni nella cella. "REPAIR può riparare le mutazioni senza manomettere il genoma, e poiché l'RNA si degrada naturalmente, è una soluzione potenzialmente reversibile, " ha spiegato il co-primo autore David Cox, uno studente laureato nel laboratorio di Zhang.

Per creare RIPARAZIONE, i ricercatori hanno sistematicamente profilato la famiglia di enzimi CRISPR-Cas13 per potenziali candidati "editor" (a differenza di Cas9, le proteine ​​Cas13 colpiscono e tagliano l'RNA). Hanno selezionato un enzima dai batteri Prevotella, chiamato PspCas13b, che era il più efficace nell'inattivare l'RNA. Il team ha progettato una variante disattivata di PspCas13b che si lega ancora a tratti specifici di RNA ma manca della sua attività "a forbice", e l'ha fusa con una proteina chiamata ADAR2, che cambia il nucleoside adenosina in inosina nei trascritti di RNA.

In RIPARAZIONE, l'enzima Cas13b disattivato cerca una sequenza bersaglio di RNA, e l'elemento ADAR2 esegue la conversione nucleosidica senza tagliare la trascrizione o fare affidamento su nessuno dei macchinari nativi della cellula.

Il team ha ulteriormente modificato il sistema di editing per migliorarne la specificità, riducendo le modifiche rilevabili fuori target da 18, 385 a solo 20 in tutto il trascrittoma. L'incarnazione aggiornata, RIPARAZIONE v2, ottenuto costantemente la modifica desiderata nel 20-40 percento, e fino al 51 percento, di un RNA mirato senza segni di significativa attività fuori target. "Il successo che abbiamo avuto nella progettazione di questo sistema è incoraggiante, e ci sono chiari segni che REPAIRv2 può essere ulteriormente evoluto per un'attività più robusta pur mantenendo la specificità, " ha detto Omar Abudayyeh, co-primo autore e uno studente laureato nel laboratorio di Zhang.

Per dimostrare il potenziale terapeutico di REPAIR, il team ha sintetizzato le mutazioni patogene che causano l'anemia di Fanconi e il diabete insipido nefrogenico legato all'X, li ha introdotti nelle cellule umane, e corretto con successo queste mutazioni a livello di RNA. Per spingere ulteriormente le prospettive terapeutiche, il team prevede di migliorare l'efficienza di REPAIRv2 e di confezionarlo in un sistema di somministrazione appropriato per introdurre REPAIRv2 in tessuti specifici in modelli animali.

I ricercatori stanno anche lavorando su strumenti aggiuntivi per altri tipi di conversioni di nucleosidi. "C'è un'immensa diversità naturale in questi enzimi, " ha detto il co-primo autore Jonathan Gootenberg, uno studente laureato sia nel laboratorio di Zhang che nel laboratorio di Aviv Regev, membro dell'istituto centrale di Broad. "Cerchiamo sempre di sfruttare il potere della natura per realizzare questi cambiamenti".

Zhang, insieme al Broad Institute e al MIT, prevede di condividere ampiamente il sistema REPAIR. Come con i precedenti strumenti CRISPR, i gruppi renderanno questa tecnologia disponibile gratuitamente per la ricerca accademica tramite la pagina del laboratorio Zhang sul sito web di condivisione di plasmidi Addgene, attraverso il quale il laboratorio Zhang ha già condiviso più di 42 reagenti, 000 volte con ricercatori a più di 2, 200 laboratori in 61 paesi, accelerando la ricerca in tutto il mondo.