I ricercatori del VIB-UGent Center for Plant Systems Biology hanno migliorato la mutagenesi multiplex, che riduce la complessità e i costi dei progetti di editing genomico su larga scala. I loro risultati sono stati pubblicati su The Plant Journal .

Gli esperimenti CRISPR/Cas sono in continua crescita, non solo in termini di numero di mutanti creati attraverso un preciso editing genomico, ma anche in termini di numero di geni che possono essere mutati simultaneamente. Il laboratorio di Thomas Jacobs del VIB-UGent Center for Plant Systems Biology ha sviluppato screening per mutare sistematicamente decine, centinaia o addirittura migliaia di geni alla volta.

L'obiettivo è migliorare l'efficienza delle mutazioni ereditarie della linea germinale e, in ultima analisi, ridurre la complessità e i costi dei progetti di editing genomico su larga scala.

Per raggiungere questo obiettivo, il team si è concentrato su due aspetti chiave della progettazione del vettore CRISPR/Cas9:il promotore che guida l’espressione di Cas9 e i segnali di localizzazione nucleare (NLS) che dirigono la proteina al nucleo. Genotipizzando migliaia di piante di Arabidopsis, hanno scoperto che l'utilizzo del promotore RPS5A per esprimere Cas9 portava al tasso di mutazione più elevato e che affiancare la proteina Cas9 con NLS bipartita era la configurazione più efficiente per creare mutazioni della linea germinale.

La combinazione di questi due elementi si traduce nella più alta efficienza di editing multiplex osservata, con il 99% delle piante che presenta almeno una mutazione knockout e oltre l'80% con da 4 a 7 mutazioni.

"Ciò rappresenta un progresso significativo nel campo della genetica vegetale e fornisce uno strumento affidabile ed efficiente per i ricercatori che si concentrano sull'ingegneria genetica complessa. Ciò che trovo particolarmente interessante è l'effetto della NLS. Oserei dire che ha avuto un effetto più forte di quello promosso ", ha affermato il dottor Thomas Jacobs, leader del gruppo presso il VIB-UGent Center for Plant Systems Biology

Le ottimizzazioni ottenute nello studio riducono significativamente la complessità e i costi dei progetti di modifica del genoma su larga scala nella scienza delle piante. Per dirla in numeri:con il loro vettore precedente, si stima che uno schermo CRISPR alla ricerca di tutti i doppi knockout di soli 20 geni richiedesse una popolazione di circa 18.000 piante. Con i nuovi vettori dovrebbero essere necessarie circa 3.000 piante.

"Queste ottimizzazioni saranno utili per generare knockout di ordine superiore nella linea germinale di Arabidopsis e probabilmente si applicheranno anche ad altri sistemi CRISPR", ha affermato Ward Develtere, Ph.D. studente e autore principale del rapporto.