1. Ridurre al minimo l'attività enzimatica:
- Molti enzimi, in particolare proteasi, sono sensibili alla temperatura e la loro attività aumenta a temperature più elevate. Mantenere il tampone di lisi e il freddo della sospensione cellulare riduce significativamente l'attività degli enzimi, prevenendo la degradazione di proteine e acidi nucleici. Ciò è particolarmente importante per isolare le proteine intatte o estrarre l'RNA di alta qualità.
2. Preservare i componenti cellulari:
- Le membrane cellulari sono composte da lipidi, che diventano più fluidi a temperature più elevate. Questa fluidità aumenta il rischio di rottura della membrana e perdite, portando alla perdita di componenti cellulari come organelli e macromolecole. Le condizioni a freddo mantengono l'integrità della membrana e prevengono il rilascio indesiderato.
3. Riduzione del degrado delle biomolecole:
- Anche le nucleasi (enzimi che degradano gli acidi nucleici) sono sensibili alla temperatura. Le condizioni del freddo aiutano a ridurre al minimo la loro attività, proteggendo il DNA e l'RNA dalla degradazione durante la lisi.
4. Rallentando i processi cellulari:
- I processi metabolici nelle cellule continuano anche dopo la lisi. Mantenendo freddo il lisato, rallenti questi processi, minimizzando ulteriormente la degradazione dei componenti cellulari e garantendo una rappresentazione più accurata dello stato cellulare.
5. Facilitare l'aggregazione proteica:
- In alcuni casi, le temperature a freddo possono effettivamente facilitare l'aggregazione di alcune proteine, che potrebbero essere desiderabili per applicazioni a valle come la purificazione delle proteine o la cristallizzazione.
Considerazioni specifiche:
- La temperatura specifica utilizzata (ad es. 0 ° C o 4 ° C) dipenderà dall'esperimento particolare e dalla sensibilità delle biomolecole target.
- L'uso di inibitori della proteasi nel tampone di lisi può minimizzare ulteriormente la degradazione delle proteine, anche a temperature più calde.
In sintesi, l'uso di una condizione ghiacciata durante la lisi cellulare è un passo cruciale per mantenere l'integrità dei componenti cellulari, prevenire la degradazione indesiderata delle biomolecole e garantire una rappresentazione più accurata dello stato cellulare.
