Elettroforesi su gel rimane una tecnica fondamentale nella biologia molecolare, poiché consente ai ricercatori di separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni e alla carica per applicazioni quali l'impronta digitale del DNA, la mappatura delle restrizioni e il sequenziamento.
Poiché il DNA stesso è incolore, gli scienziati aggiungono coloranti traccianti, pigmenti blu o arancioni, al campione. Questi coloranti migrano insieme al DNA, fornendo un riferimento visivo che consente all'utente di valutare i progressi e garantire un'identificazione accurata della banda.
In questo metodo, una lastra di gel di agarosio —un polisaccaride derivato dalle alghe marine—viene preparato mescolando polvere di agarosio con un tampone contenente acqua e sale. La miscela viene riscaldata finché l'agarosio non si scioglie, quindi raffreddata per formare una matrice porosa. Il gel viene posto in una camera per elettroforesi e coperto con un tampone conduttivo.
I campioni di DNA, combinati con un colorante di caricamento, vengono caricati nei pozzetti all'estremità negativa (-) del gel. Un elettrodo positivo (+) è posizionato sul lato opposto. La struttura fosfato del DNA, carica negativamente, guida i frammenti verso l'elettrodo positivo quando viene applicato il campo elettrico.
I frammenti più piccoli incontrano meno resistenza e viaggiano più velocemente, producendo bande distinte che corrispondono alla dimensione del frammento.
I coloranti di caricamento svolgono due funzioni principali:aumentano la densità del campione in modo che affondi nel pozzetto e forniscono un segnale visivo che traccia la migrazione del DNA. I coloranti comuni includono il blu di bromofenolo (ottimale per frammenti intorno a 400bp) e xilene cianolo (più adatto per frammenti da 2–8 kbp). Il colorante viene scelto in modo che non reagisca o alteri il DNA. I ricercatori in genere utilizzano 5 µl di colorante di caricamento per 1 µl di campione di DNA, seguendo le linee guida di NEB e Thermo Fisher.
Il glicerolo viene aggiunto al campione per aumentarne la densità. Senza glicerolo, il campione liquido si diffonderebbe sulla superficie del gel invece di depositarsi ordinatamente nel pozzetto, compromettendo la formazione di bande chiare e distinte.
Per la separazione delle proteine, l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato e poliacrilammide (SDS‑PAGE) sostituisce l'agarosio. Il blu di bromofenolo viene normalmente incorporato nel tampone del campione; viaggia alla stessa velocità del bordo anteriore delle bande proteiche, offrendo un indicatore visivo del progresso in tempo reale.
Dopo l'elettroforesi, coloranti che legano il DNA come il bromuro di etidio vengono applicati. Il bromuro di etidio si intercala tra le basi del DNA e emette una fluorescenza brillante sotto la luce ultravioletta, rendendo visibili le bande. Poiché è mutageno, sono necessarie rigorose precauzioni di sicurezza durante la manipolazione e lo smaltimento del colorante.
