Figura 1. Strutture di Cas9. Da sinistra a destra:solo Cas9 (apo-Cas9), Cas9 legato all'RNA (Cas9-RNA), Cas9-RNA legato al suo bersaglio di DNA a filamento singolo (Cas9-RNA-DNA), Cas9-RNA legato a un duplex parziale di DNA (Cas9-RNA-DNA) e Cas9-RNA legato al suo bersaglio di DNA a doppia elica (Cas9-RNA-DNA). Credito:Università di Kanazawa
I ricercatori dell'Università di Kanazawa e dell'Università di Tokyo riferiscono in Comunicazioni sulla natura la visualizzazione della dinamica delle "forbici molecolari", il meccanismo principale della tecnica di ingegneria genetica CRISPR-Cas9.
Una delle tecniche utilizzate nell'ingegneria genetica, il processo di modifica artificiale del genoma di un organismo vivente, coinvolge il cosiddetto sistema nucleasi CRISPR-Cas9. Utilizzando questo sistema, il DNA di una cellula può essere tagliato in un sito desiderato, dove i geni possono essere cancellati o aggiunti. La selezione del sito da tagliare viene effettuata da una molecola di 'RNA guida' legata alla proteina Cas9. Ora, un team di ricercatori guidato da Mikihiro Shibata dell'Università di Kanazawa e Osamu Nureki dell'Università di Tokyo ha visualizzato le dinamiche del complesso CRISPR-Cas9, in particolare come taglia il DNA, fornendo preziose informazioni sul meccanismo di scissione del DNA mediato da CRISPR-Cas9.
Per i loro studi sulla visualizzazione, gli scienziati hanno utilizzato la microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM), un metodo per l'imaging delle superfici. Una superficie viene sondata spostandovi sopra un minuscolo cantilever; la forza subita dalla sonda può essere convertita in una misura di altezza. Una scansione dell'intera superficie risulta quindi in una mappa dell'altezza del campione. Il set-up sperimentale ad alta velocità di Shibata e colleghi ha permesso di ottenere risultati estremamente rapidi, scansioni ripetute, convertibili in filmati, delle biomolecole che partecipano all'azione di forbice molecolare.
Primo, gli scienziati hanno confrontato Cas9 senza e con RNA attaccato (Cas9-RNA). Hanno scoperto che il primo era in grado di adottare in modo flessibile varie conformazioni, mentre quest'ultimo ha un fisso, struttura a due lobi, evidenziando la capacità di stabilizzazione conformazionale dell'RNA guida. Quindi, Shibata e colleghi hanno esaminato come il complesso Cas9-RNA stabilizzato prende di mira il DNA. Hanno confermato che si lega a un sito protospacer adiacente motivo (PAM) preselezionato nel DNA. Un PAM è una breve sequenza nucleotidica situata vicino al sito bersaglio del DNA, che è complementare all'RNA guida.
I filmati ad alta velocità del team di ricerca hanno inoltre rivelato che il targeting ("interrogazione del DNA") si ottiene attraverso la diffusione 3-D del complesso Cas9-RNA. Finalmente, i ricercatori sono riusciti a visualizzare la dinamica del processo di scissione stesso:hanno osservato come la regione delle "forbici molecolari" subisce fluttuazioni conformazionali dopo che Cas9-RNA svolge localmente il DNA a doppio filamento (Film 1 [URL]).
Figura 2. Filmati HS-AFM della scissione del DNA da parte di Cas9-RNA. Le fluttuazioni del dominio della nucleasi sono indicate da frecce magenta. I prodotti di scissione rilasciati da Cas9-RNA sono indicati da frecce blu. Credito:Università di Kanazawa
Il lavoro di Shibata fa progredire la nostra comprensione del meccanismo di modifica del genoma CRISPR-Cas9. Nelle parole dei ricercatori:"... questo studio fornisce dettagli senza precedenti sulla dinamica funzionale di CRISPR-Cas9, e mette in evidenza il potenziale di HS-AFM per chiarire i meccanismi di azione delle nucleasi effettrici guidate da RNA da sistemi CRISPR-Cas distinti".
CRISPR-Cas9
CRISPR, abbreviazione di "brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate", si riferisce a un insieme di sequenze di DNA batterico contenenti frammenti del DNA di virus che hanno precedentemente attaccato i batteri. Questi frammenti vengono utilizzati dai batteri per prevenire ulteriori attacchi da parte degli stessi virus. "Cas" si riferisce ai geni associati a CRISPR; "Cas9" è una proteina associata a CRISPR con due domini nucleasi (Una nucleasi è un enzima in grado di scindere gli acidi nucleici, molecole organiche presenti nel DNA e nell'RNA).
Negli ultimi anni, è stata sviluppata una tecnica di ingegneria genetica in cui un complesso CRISPR-Cas9 funge da 'forbici molecolari'; la nucleasi Cas9 si lega a una molecola di RNA guida che contiene informazioni sul sito di DNA da colpire. Utilizzando la microscopia a forza atomica ad alta velocità, Mikihiro Shibata dell'Università di Kanazawa e colleghi hanno ora studiato in dettaglio le dinamiche del complesso CRISPR-Cas9.
Microscopia a forza atomica
La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica di imaging in cui l'immagine viene formata mediante la scansione di una superficie con una punta molto piccola. Il movimento di scansione orizzontale della punta è controllato tramite elementi piezoelettrici, mentre il movimento verticale viene convertito in un profilo in altezza, resulting in a height distribution of the sample's surface. As the technique does not involve lenses, its resolution is not restricted by the so-called diffraction limit. In a high-speed setup, AFM can be used to produce movies of a sample's evolution in real time. High-speed AFM has been used successfully to study protein dynamics, for example myosin V walking on an actin filament, the photo-induced conformational change of bacteriorhodopsin, and the degradation of cellulose. Shibata and colleagues have now applied the high-speed AFM technique for visualizing the dynamics of DNA cleavage by CRISPR-Cas9.
