Comstock/Comstock/Getty Images
Prima che il DNA possa essere sequenziato o modificato, i ricercatori devono prima isolarlo dalla matrice cellulare. Sebbene le cellule contengano un mix di proteine, lipidi, carboidrati e piccole molecole, le proprietà chimiche uniche del DNA ne consentono la separazione e la purificazione per l'analisi a valle.
Il passaggio iniziale in qualsiasi flusso di lavoro di estrazione del DNA è la lisi cellulare. A seconda del tipo di campione e della purezza richiesta, i laboratori scelgono tra metodi meccanici, enzimatici o basati su detergenti. I detergenti solubilizzano le membrane cellulari, le onde ultrasoniche ad alta frequenza (sonicazione) interrompono le membrane attraverso la cavitazione e la battitura delle sfere, in cui le sfere di vetro vibrano contro il campione, fornisce una rapida disgregazione fisica che rilascia acidi nucleici.
Quando la velocità supera la purezza, gli scienziati a volte impiegano una pulizia minima. L'aggiunta di proteinasiK degrada la maggior parte delle proteine, consentendo di utilizzare il campione solo con una purificazione blanda. In alternativa, elevate concentrazioni di sale (ad esempio acetato di ammonio o di potassio) fanno precipitare le proteine, ma rimangono molti altri contaminanti. Questi metodi sono adatti per uno screening rapido ma non sono adatti per applicazioni che richiedono DNA di alta qualità.
L’estrazione con fenolo-cloroformio rimane una tecnica classica, sebbene ora sia meno comune a causa della tossicità e dell’intensità del lavoro. Le cellule vengono lisate con detergente, quindi miscelate con una miscela di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico. Dopo la centrifugazione, la soluzione si separa in una fase acquosa (in basso) che trattiene il DNA e una fase organica (in alto) che cattura proteine e lipidi. Un attento controllo della concentrazione di sale e del pH è essenziale per un recupero ottimale. Poiché il fenolo e il cloroformio sono pericolosi, molti laboratori sono passati ad alternative più sicure.
La cromatografia a scambio anionico offre purezza e riproducibilità più elevate. La matrice della colonna contiene gruppi caricati positivamente che legano il DNA caricato negativamente. Le proteine, l'RNA e altri contaminanti vengono lavati via e il DNA viene successivamente eluito con un tampone ad alto contenuto di sale. Questo metodo è particolarmente utile per la purificazione su scala preparativa.
I kit di colonne rotanti a base di silice sono diventati lo standard di riferimento per la purificazione del DNA rapida e riproducibile. Il DNA si lega ad una membrana di silice in presenza di sali caotropici, mentre i contaminanti vengono lavati via. Dopo un risciacquo finale a basso contenuto di sale, il DNA viene eluito in un piccolo volume di TE o acqua, producendo materiale di alta qualità in pochi minuti.
Dopo l'isolamento, la soluzione di DNA viene generalmente posta in un tampone a pH controllato. La sua purezza viene verificata misurando l'assorbanza ultravioletta a 260 nm e 280 nm. Un rapporto 260/280 di ~1,8 indica elevata purezza, mentre rapporti inferiori suggeriscono una contaminazione proteica. L'assorbanza a 260 nm fornisce anche una stima semplice della concentrazione di DNA.
