Di Andy Pasquesi | Aggiornato il 24 marzo 2022
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L'elettroforesi su gel è una tecnica fondamentale nella biologia molecolare che separa i frammenti di DNA in base alle dimensioni e li rivela per l'analisi. Incorporando campioni di DNA in una matrice di gel di agarosio e applicando un campo elettrico, i filamenti caricati negativamente migrano verso l'anodo, con i frammenti più corti che viaggiano più velocemente di quelli più lunghi.
Il bromuro di etidio (EtBr) è incorporato nella miscela di agarosio (polvere di agarosio, tampone EDTA, acqua). Una volta che il gel polimerizza, l'EtBr viene distribuito uniformemente in tutta la matrice. Dopo aver caricato i campioni di DNA e tracciato i coloranti nei pozzetti, il gel viene sottoposto a una tensione controllata che attira il DNA attraverso i pori.
Mentre i filamenti si muovono, l'EtBr si intercala tra le coppie di basi, legandosi temporaneamente al DNA e trasportando con sé il segnale di fluorescenza. Alla fine della corsa, ciascun frammento ha assorbito una notevole quantità di EtBr. L'illuminazione del gel con un transilluminatore UV eccita il colorante legato, facendo brillare le bande di DNA. Una fotocamera calibrata cattura l'immagine per la documentazione.
Quando non è disponibile un transilluminatore UV, il gel può essere colorato con blu di metilene. Dopo l'elettroforesi, l'immersione del gel per una notte in una soluzione di blu di metilene consente al colorante di penetrare nella matrice e legarsi al DNA tramite legami idrogeno. La colorazione blu risultante è visibile a occhio nudo e rappresenta un'alternativa semplice ed economica alla fluorescenza.
Coloranti traccianti, come il blu di bromofenolo e lo xilene cianolo, vengono aggiunti al tampone di caricamento per monitorare i progressi senza interferire con la migrazione del DNA. Il blu di bromofenolo si muove a una velocità equivalente a circa 300 nucleotidi, mentre lo xilene cianolo corrisponde a circa 4.000 nucleotidi. Confrontando la posizione di una banda di DNA con questi marcatori, i tecnici possono stimare la dimensione del frammento in coppie di basi.
In sintesi, l'elettroforesi su gel abbinata a coloranti di colorazione e tracciamento appropriati consente la visualizzazione e il dimensionamento precisi dei frammenti di DNA, costituendo la base di innumerevoli analisi genetiche.
