1. Estrazione e preparazione delle proteine:
- Il primo passo è estrarre le proteine dal campione di interesse. Questo può essere fatto utilizzando vari metodi, come la lisi cellulare o l'omogeneizzazione dei tessuti, seguita dalla centrifugazione per rimuovere i detriti cellulari.
- Le proteine estratte vengono quindi quantificate, in genere utilizzando un test Bradford o metodi simili, per garantire un uguale carico proteico nelle fasi successive.
2. Separazione delle proteine:
- Il campione proteico viene miscelato con un tampone di caricamento contenente un agente riducente (ad esempio beta-mercaptoetanolo o DTT) e un colorante tracciante (ad esempio blu di bromofenolo).
- La miscela proteica viene caricata su un gel di poliacrilammide per l'elettroforesi. Il gel viene sottoposto a corrente elettrica, provocando la separazione delle proteine in base alla loro dimensione. Le proteine più piccole migrano più velocemente attraverso il gel, mentre le proteine più grandi si muovono più lentamente.
3. Trasferimento di proteine:
- Dopo l'elettroforesi, le proteine separate vengono trasferite dal gel su una membrana di nitrocellulosa o membrana di poliviniliden difluoruro (PVDF). Questo processo, noto come blotting proteico o elettroblotting, prevede il posizionamento del gel e della membrana in un tampone di trasferimento e l'applicazione di una corrente elettrica.
- Di conseguenza, le proteine vengono trasferite dal gel sulla membrana, creando una replica delle proteine separate.
4. Blocco della membrana:
- Per ridurre il legame non specifico degli anticorpi, la membrana di nitrocellulosa o PVDF viene bloccata con una soluzione contenente una proteina come l'albumina sierica bovina (BSA) o il latte in polvere non grasso.
- Questa fase di blocco aiuta a ridurre al minimo i segnali di fondo e migliora la specificità del legame degli anticorpi durante le fasi successive.
5. Incubazione dell'anticorpo primario:
- La membrana viene incubata con un anticorpo primario che riconosce e si lega specificamente alla proteina di interesse. Gli anticorpi primari vengono tipicamente generati contro la proteina bersaglio o un epitopo specifico all'interno della proteina.
- Questi anticorpi vengono diluiti in un tampone appropriato e incubati con la membrana, consentendo loro di legarsi alle proteine bersaglio.
6. Lavaggio:
- Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, la membrana viene lavata accuratamente per rimuovere gli anticorpi non legati e ridurre i segnali di fondo. Questa fase di lavaggio è fondamentale per garantire il rilevamento specifico della proteina bersaglio.
7. Incubazione dell'anticorpo secondario (coniugato con un enzima reporter):
- Un anticorpo secondario, coniugato a un enzima come la perossidasi di rafano (HRP) o la fosfatasi alcalina (ALP), viene utilizzato per rilevare i complessi antigene-anticorpo primario sulla membrana.
- Gli anticorpi secondari sono specie-specifici, nel senso che riconoscono e si legano agli anticorpi primari prodotti in una particolare specie (ad esempio topo o coniglio).
- L'anticorpo secondario coniugato con l'enzima si lega all'anticorpo primario, creando un complesso che consente l'amplificazione e la visualizzazione del segnale.
8. Lavaggio:
- Viene eseguita un'altra fase di lavaggio per rimuovere gli anticorpi secondari non legati e ridurre i segnali di fondo.
9. Rilevazione chemiluminescente:
- Per gli anticorpi secondari coniugati con HRP, alla membrana viene aggiunto un substrato chemiluminescente. Quando il substrato reagisce con l'HRP, emette luce.
- Per catturare e visualizzare i segnali luminosi emessi vengono utilizzati sistemi specializzati di rilevamento a chemiluminescenza o pellicole radiografiche. L'intensità della luce corrisponde alla quantità di proteina bersaglio presente nel campione.
10. Analisi e interpretazione dei dati:
- La pellicola radiografica sviluppata o le immagini digitali in chemiluminescenza vengono analizzate per identificare bande o punti corrispondenti alla proteina bersaglio.
- La dimensione e l'intensità di queste bande possono fornire informazioni sul peso molecolare, sull'abbondanza e sulle modifiche post-traduzionali della proteina rilevata.
Seguendo questi passaggi, il western blotting consente il rilevamento e l'analisi specifici di una proteina di interesse in una miscela complessa di proteine. È ampiamente utilizzato in vari campi della ricerca biologica, tra cui biologia molecolare, immunologia e diagnostica clinica.
